长链非编码RNA linc-PINT通过调控SMAD4抑制结直肠癌的恶性进展

章帅 黄迪 王晓元 李曙光

河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科（河北张家口 075000）

无论在世界范围内还是在中国，结直肠癌的发病率和病死率均居于癌症相关疾病的前五位，严重威胁着人类的身心健康［1-2］。尽管结直肠癌的手术、新辅助化疗、辅助化疗和靶向治疗等各种治疗策略取得了很大进展，但结直肠癌的预后，尤其晚期患者的预后仍然不是十分乐观。因此，有必要深入了解结直肠癌的发病机制，尤其是远处扩散的分子机制。在过去的几十年里，诸多学者探索了结直肠癌相关诊断、判断预后的各种分子标记物和潜在分子机制，但均未发现能用于临床诊断和治疗的有效分子或明确结直肠癌的进展机制［3］。最近，有证据［4-5］表明，长链非编码RNA也可作为结直肠癌进展的调节剂，并且具有作为新的治疗靶点的潜力。

长链非编码RNA，其长度大于200个核苷酸，作为一种新的基因调控分子，不具有编码蛋白质的潜力［6］。有研究表明，长链非编码RNA广泛的存在于细胞的各种生物学过程中，如上皮-间质转化［7］、细胞侵袭迁移［8］和分化［9］等。同样，长链非编码RNA的异常表达也参与调节了许多肿瘤的恶性生物学进展，包括结直肠癌。

长链非编码RNA PINT（linc-PINT），是在人体中普遍表达并由p53诱导产生的一种转录产物。有研究已经证明linc-PINT通过诱导细胞凋亡和DNA损伤来调节肿瘤细胞增殖［10］。此外，LI等［12］研究发现，linc-PINT在胰腺癌患者血清中显著低表达，并且其低表达与肿瘤复发和预后不良显著相关，有望成为胰腺癌早期诊断和判断预后的生物标记物。然而，linc-PINT在结直肠癌中的作用尚未见相关研究。因此，本研究首先检测其在结直肠癌组织中的表达水平，进而检测其对结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，并初步探索其调控结直肠癌进展的分子机制，为探索结直肠癌诊断标记物，为监测结直肠癌患者预后转归，为结直肠癌靶向治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及组织本研究纳入我院2012年1月至2012年12月确诊为结肠癌且资料完整的病例60例，所有患者术前均未接受除手术以外的其他抗肿瘤治疗，60例患者均获得新鲜结直肠癌组织及正常结直肠黏膜组织。采用电话或病案系统对60例患者从术后第一天开始随访，内容主要包括患者复查结果和生存情况，随访至2017年6月21日或者患者死亡。

人结肠癌细胞株SW480，SW620，HT29，LoVo，HCT116、RKO细胞和正常结肠粘膜细胞NCM460购自中科院细胞库，并由我们实验室进行传代培养和保存。细胞在含有10%胎牛血清（Gibco，美国）、100 U/mL青霉素（Sigma-Aldrich，美国）和100 μg/mL链霉素（Sigma-Aldrich，美国）的Dulbecco′s Modified Essential Medium（DMEM）培养基中培养，并将细胞放置在37℃，5%CO2孵育箱中培养。

1.2 主要试剂RNA trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；荧光定量试剂盒购自美国伯乐公司；linc-PINT（Forward：CGTGGGAGCCCCTTTAAGTT，Reverse：GGGAGGTGGCGTAGTTTCTC）、SMAD4（Forward：GCTGCAGAGCCCAGTTTAGA，Reverse：CCCCAAAGCAGAAGCTACGA）和 GAPDH（Forward：CCTCTGACTTCAACAGCGACAC，Reverse：TGGTCCAGGGGTCTTACTCC）引物由生工生物（北京）有限公司设计合成；linc-PINT过表达质粒由苏州吉玛基因股份有限公司提供；Lipofectamine 3000转染试剂购买于美国life公司；培养基及胎牛血清购买于美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒由日本同仁公司提供；Matrigel基质胶购买于美国BD公司；Transwell小室购买于美国康宁公司；SMAD4购自Abcam公司。

1.3 细胞转染（1）铺板：转染前一天将细胞接种于6孔板，每个组有三个复孔，保证第二天转染时细胞密度可以达到70%。（2）转染：转染前每个6孔板更换为新的1.8 mL完全培养基。按转染试剂说明书步骤，分别稀释过表达质粒和转染试剂。6孔板：在每个1.5 mL无菌EP管中分别加入125 μL Opti-MEM，然后向每个EP管中加入2.5 μg pcDNA3.1-linc-PINT得到质粒稀释液；向另外3个EP管中加入2.5μl Lipofectamine®3000，得到Lipofectamine®3000稀释液；迅速将上述两种液体轻轻混匀，室温孵育5 min。（3）将上述混合液加入到6孔板中，轻轻混匀，放入细胞培养箱中继续培养24～48 h后收获细胞，继续实验。

1.4 实时定量PCR（qRT-PCR）提取总RNA：称取30 mg组织（6孔板中生长状态良好的实验组和对照组细胞）加入500 μL TRIzol裂解5 min，然后加入100 μL氯仿，室温静置3 min，12 000转离心15 min，将上层透明液体移入新的EP管中，加入250 μL异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000转离心10 min，弃上清液，用75%乙醇溶液（DEPC：无水乙醇=1：3）洗涤沉淀3次，每次7 500转离心5 min），待沉淀基本透明时加入DEPC水，58℃水浴至充分溶解，测定RNA的浓度及质量。

按照takara RR036A试剂盒说明书逆转录合成cDNA，在10 μL反应体系中加入500 ng总RNA。按照伯乐qPCR检测试剂盒通过qRT-PCR测定linc-PINT的表达水平，用2×SYBR Green PCR Master Mix，取0.8 μL上述步骤得到的cDNA作为模板，引物浓度0.4 μmol/L，10 μL反应体系中进行扩增，使用CFX96实时PCR检测系统。人GAPDH作为内参。试验独立重复3次，每次设3个复孔，目的基因的表达水平应用2-ΔΔCt方法进行相对定量。

1.5CCK-8增殖实验（1）铺板：收集细胞，消化、离心，制成单细胞悬液，混匀计数，调整细胞密度为2×104个/mL。在96孔板中每孔加入100 μL单细胞悬液，每组设6个重复孔。（2）检测：第一天在细胞贴壁2 h后检测，随后在24、48、72、96 h同一时间点检测共5 d。检测时，更换96孔板中的培养基，向每个孔加入CCK-8试剂10 μL，轻轻混匀，置于培养箱中2 h，用酶标仪检测每个孔的吸光度，波长在450 nm。（3）绘制生长曲线：以时间点为横坐标，以每个时间点的吸光度平均值±标准差为纵坐标，绘制生长曲线。

1.6Transwell迁移实验实验前一天将Matrigel基质胶置于4℃过夜融化。EP管、枪头等实验耗材置于-20℃预冷。（1）铺板：收集细胞，消化离心，用DMEM无血清培养基稀释成单细胞悬液，将含有6×104个细胞的200 μL悬液加到上室，在下室加入600 μL DMEM完全培养基，置于培养箱中继续培养48 h。（2）固定、染色：培养48 h后，倒掉上室中的液体，用PBS清洗3次，4%甲醛固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min，加入0.1%结晶紫水溶液染色10 min，PBS清洗3次，每次5 min，用棉签轻轻擦掉未发生迁移的细胞。（3）拍照、细胞计数：将小室晾干，在显微镜下随机选取5个视野观察、拍照并计数迁移的细胞。

1.7Western blot（1）向6孔板中加入500 μL裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1配制），冰上充分裂解30 min，4℃，12 000 g离心30 min，取2 μL上清液应用BCA法测定蛋白浓度，剩余上清液加入5×Loading buffer（体积之比为 4∶1）混合均匀，100 ℃蛋白变性8 min。（2）根据蛋白分子量，按照凝胶配制成分表配制分离胶，上样蛋白量为40 μg，设定电压为100 V，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，取出分离胶，切取凝胶，设置电压120 V，进行转膜约1 h，完成后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中封闭1 h，取出PVDF膜放入一抗中（SMAD4，1∶1 000），4℃孵育过夜。次日，用TBST清洗3次，每次10 min，加入相应二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，显影。

1.8统计学方法应用SPSS 20.0软件统计学分析，所有细胞功能数据采用均数±标准差表示，应用非配对样本t检验分析；linc-PINT在肿瘤组织与正常组织间的表达水平采用配对样本t检验分析，其与临床病理特征的关系采用检验和Fisher精确概率法分析计算，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法；P≤0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1Linc-PINT在结直肠癌组织及细胞中的表达Linc-PINT在60例结肠癌肿瘤组织中的相对表达量为1.35±0.80，显著低于其在相应正常组织中的3.67±1.56，差异具有统计学意义（图1A）。Linc-PINT在 HCT116、HT29、LOVO、RKO、SW620和SW480等6种结肠癌细胞株中的相对表达量均显著高于其在正常人结肠黏膜细胞NCM460中的相对表达量，差异均有统计学意义，其中在RKO细胞中的相对表达量最低（均P＜0.05，图1B）。

图1 qRT-PCR检测Linc-PINT在结直肠癌中的表达Fig.1 The expression of Linc-PINT in colorectal cancer was detected using qRT-PCR

2.2Linc-PINT的表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系以Linc-PINT在结肠癌肿瘤组织中的表达水平从高到低排序，以中位数为界，大于中位数为高表达组，小于中位数为低表达组。Linc-PINT低表达与患者的分期和肝转移呈正相关相关（均P＜0.05，表1），而与年龄、性别、肿瘤大小、分化、淋巴结转移、分期等情况无明显相关性（均P ＞0.05，表1）。

表1 Linc-PINT的表达水平与结直肠癌患者临床病理特征间的关系Tab.1 Relationship between the linc-PINT expression and clinicopathological features of colorectal cancer patients

2.3 结肠癌患者预后的单因素生存分析单因素分析结果显示，结肠癌患者的预后与临床分期、淋巴结转移、远处转移及linc-PINT的表达显著相关，差异具有统计学意义（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度等无相关性，差异无统计学意义（均P＞0.05）（表2）。linc-PINT低表达结肠癌患者的中位生存时间为33个月，明显差于linc-PINT高表达患者60个月的中位生存时间，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.4 Linc-PINT对结肠癌细胞增殖及迁移的抑制作用应用CCK-8实验检测linc-PINT对细胞增殖的影响，结果表明过表达linc-PINT后，结肠癌细胞SW480的增殖能力明显下降（图3A）；Transwell实验结果表明，过表达linc-PINT后，发生迁移的SW480细胞数显著减少（279.0±11.14vs.109.0±7.41，P＜ 0.05）（图3B）。结果提示linc-PINT可显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力。

2.5 Linc-PINT与SMAD4在结肠癌肿瘤组织中的表达关系Pearson相关分析显示，Linc-PINT在结肠癌肿瘤组织中的表达水平与SMAD4在结肠癌肿瘤组织中的表达水平呈正相关（图4A；r=0.592，P＜0.05）。与对照组相比，过表达linc-PINT后SMAD4蛋白的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（图4B）。

表2 Linc-PINT的表达与结直肠癌患者的预后单因素分析Tab.2 Linc-PINT expression and univariate analysis of prognosis in patients with colorectal cancer

图2 Linc-PINT低表达结直肠癌患者较高表达患者预后差Fig.2 Colorectal cancer patients with linc-PINT lowexpression have poor prognosis than patients with linc-PINT high expression

图3 Linc-PINT抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移Fig.3 Linc-PINT inhibits proliferation and migration of colorectal cancer cells

图4 Linc-PINT与SMAD4的关系Fig.4 Relationship between Linc-PINT and SMAD4

3 讨论

结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，结直肠癌患者的预后通常很差。目前，由于缺乏疾病早期特异性症状，许多结直肠癌患者在诊断时就已被确诊为晚期，治疗效果不佳［12］。因此，迫切需要新的诊断和监测预后的生物标志物和治疗靶点来改善结直肠癌患者的结局。

近年来，长链非编码RNA的发现引起了全世界研究人员的兴趣。许多长链非编码RNA在人类肿瘤组织中异常表达并在调节肿瘤进展中发挥不可忽视的作用［13］。其中，有研究发现linc-PINT能够诱导细胞凋亡并在胰腺癌患者中异常表达［10-11］。然而，目前仍不清楚linc-PINT是否以及如何调控结直肠癌患者的恶性生物学进展。因此，在本研究中，笔者首次研究并报道了linc-PINT在60对结直肠癌肿瘤组织及其相应正常组织中的表达水平，研究发现，与正常组织相比，linc-PINT在结直肠癌肿瘤组织中呈显著低表达，提示linc-PINT可能在抑制结直肠癌进展中起重要作用。此外，分析linc-PINT的表达水平与60例结肠癌患者的临床病理特征之间的关系发现linc-PINT的表达水平与患者肿瘤分期和肝转移显着相关，进一步表明linc-PINT在结直肠肿瘤发展中起重要作用，提示其有望成为预测结直肠癌患者病情进展的分子之一。Kaplan-Meier分析显示低水平的linc-PINT与结肠癌患者的预后不良密切相关。因此，这些发现表明linc-PINT可能是结肠癌患者的新型预后监测指标和潜在的治疗靶点。

为进一步研究linc-PINT在结直肠癌中的作用，本研究继续检测了linc-PINT在6种结肠癌细胞株（SW480，SW620，HT29，LoVo，HCT116、RKO）及结肠正常粘膜细胞（NCM460）中的表达水平，结果发现其在6种结肠癌细胞中的表达量均明显低于其在NCM460中的表达水平，且SW480的表达最低，因此，我们选择在SW480细胞中过表达linc-PINT进行下一步实验研究。CCK-8实验结果显示过表达linc-PINT后，SW480细胞的生长能力显著受到抑制，同样，Transwell实验发现linc-PINT对SW480细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。因此，这些观察结果以及来自临床研究的数据强烈表明linc-PINT可能抑制结直肠肿瘤的发生、发展。

另有研究［10］分析linc-PINT与KEGG信号通路的相关性发现，linc-PINT与TGF-β信号通路成正相关。而SMAD4作为TGF-β信号通路的重要介质，在抑制肿瘤进展和促进肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用［14-15］。同样，Smad4突变和下调导致许多癌症进展，如Smad4低表达与乳腺癌的发生发展相关［16］；敲低SMAD4降低了肝癌细胞的集落形成和迁移能力［17］。SMAD4在结直肠癌中的作用也得到了广泛研究，有研究［18］表明Smad4重新表达后增加了结直肠癌对小白菊内酯的敏感性；MicroRNA-20a-5p通过下调Smad4促进结直肠癌侵袭和转移［19］；Smad4可以通过抑制VEGF-C的表达而减少淋巴管形成，进而减弱结肠癌细胞的迁移能力［20］。以上研究提示linc-PINT可能通过提高SMAD4表达而抑制结直肠癌的发生发展。因此，我们应用qRT-PCR检测SMAD4在60例结肠癌肿瘤组织中的表达情况，结果发现Linc-PINT在结肠癌肿瘤组织中的表达水平与SMAD4在结肠癌肿瘤组织中的表达水平呈正相关。另外，过表达linc-PINT后，SMAD4的蛋白水平显著升高。因此，这些结果初步表明，Linc-PINT通过SMAD4介导结直肠肿瘤的发生发展。

综上所述，目前的研究表明linc-PINT在结肠癌肿瘤组织和细胞系中显著下调，linc-PINT可通过提高SMAD4表达水平来抑制结肠癌细胞增殖和迁移。linc-PINT在结直肠肿瘤进展中起重要作用，为诊断和监测结直肠癌提供了候选生物标志物，为结直肠癌患者的治疗提供了新的思路和理论基础。然而，本研究仍存在一定的局限性，本实验结果仅在结肠癌SW480细胞中过表达linc-PINT进行功能学实验，未经过其他细胞敲低实验进行验证，并且未进行动物模型的验证，Linc-PINT可能不仅仅通过SMAD4调节结直肠癌的发展，还存在多个途径或其详细调控机制仍需要进一步探索。针对本实验不足之处，我们下一步将在SW620细胞中敲低linc-PINT的表达，检测其对细胞增殖和迁移的影响，通过裸鼠皮下成瘤和肝肺转移模型进行验证，并通过信号通路芯片筛选Linc-PINT调控SMAD4的详细机制。