Toll样受体4拮抗剂厄立特兰对抑郁症大鼠前额叶和海马神经元发生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影响

丁迎 戢汉斌 陈钰 苏邹

湖北省武汉市武东医院（武汉市第二精神病医院）康复科（武汉 430084）

抑郁症临床上常见的病症，病因相对复杂［1］。抑郁症主要是心情或情感性精神障碍，全球约20%的人群受抑郁症的困扰［2］。目前，对于抑郁症的治疗方式很多，但抑郁症很难被完全治愈。抑郁症发病的原因是单胺类神经递质的异常导致的［3］，但这种说法并不能充分阐释抗抑郁症药物的作用机制，这说明抑郁症的发病也有可能是由于其他神经递质如氨基酸类神经递质异常导致的。海马是大脑中与情绪认知相关的区域，是一个重要的边缘结构系统［4］。海马作为应激反应的靶区，经常在抑郁症和情绪应激的研究中被涉及，并可参与学习记忆和情绪反应等活动［5］。大脑前额叶皮质mPFC是控制情绪的中枢组分，抑郁症患者的mPFC背外侧区结构会发生改变［6-7］。长期慢性应激可诱发海马和mPFC神经元受损，从而使中枢神经系统发生紊乱。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸（glutamate，Glu）是主要的抑制性和兴奋性递质［8］。在抑郁症患者的部分脑区域中，GABA和Glu的浓度异常，平衡被破坏［9］。Toll样受体4（Toll-like recept 4，TLR4）是Toll样受体中最早被发现的亚型之一，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，在多种组织和细胞中分布十分广泛［10］。研究证实，TLR4具有促进炎症因子分泌的功能，从而引发机体的炎症反应。同时，TLR4还可促进免疫反应过程中免疫细胞的成熟与分化，具有抗病毒、介导全身免疫病理损伤、调节免疫应答等生理功能［11］。由于TLR4在炎症反应中的信号转导作用，其在与炎症相关的疾病中的功能成为了研究的热点。TLR4是一种模式识别受体，能够识别坏死细胞以及热休克蛋白（HSP60、HSP70）等。在神经受损部分会产生大量的坏死细胞以及HSP60和HSP70，故TLR4在神经损伤性疾病中的作用，受到了更多的关注。目前，对于TLR4在脑神经系统损伤中的研究仍不多。因此，本研究的创新点即是采用Toll样受体4拮抗剂厄立特兰（TAK-242）作用于抑郁症大鼠模型，探讨TLR4对抑郁症大鼠模型前额叶（mPFC）和海马神经元发生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影响，以为临床诊治提供理论依据和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料与仪器雄性SD大鼠，体质量约为240～ 280 g，合格证号：SCXK（沪）0054756，购自上海斯莱克景达有限公司。Toll样受体4拮抗剂TAK-242购自美国MCE公司；兔抗小鼠TLR4抗体购自美国CST公司；山羊抗兔β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；组织裂解蛋白提取液和BCA蛋白浓度试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；5-HT ELISA试剂盒、Glu ELISA试剂盒和GABA ELISA试剂盒购自R&D公司。Western发光成像系统购自美国UVP公司；全自动酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2实验方法

1.2.1实验分组及给药选取60只SD雄性大鼠，适应性饲养3 d后，随机分为2批，每批SD大鼠随机分为3组：正常对照组（Control组）、模型组［用长期轻度不可预见性应激（CUMS）加孤养复制大鼠抑郁症模型，Model组］和治疗组［Model+TAK-242（3 mg/kg）］。第1批30只大鼠用于自发活动和强迫游泳测试；第2批30只大鼠用于5-羟色胺（5-HT）、GABA及谷氨酸Glu含量的检测，以及TLR4蛋白表达的测定。

正常对照组大鼠进行合笼饲养，其余各组大鼠进行单只孤养。模型组和治疗组大鼠建立CUMS抑郁症模型，连续21 d接收不同的刺激，每天选取以下任意一种刺激：24 h禁水、24 h禁食、夹尾1 min、悬尾1 min、通宵照明、4℃冷水游泳5 min、100 V电击足底1 min、40℃烘箱热烘5 min等，顺序随机，使大鼠受到不能预料的刺激。治疗组大鼠同时注射TAK-242（3 mg/kg）21 d，治疗组和模型组大鼠采取腹腔注射同体积的生理盐水。

1.2.2旷场试验和强迫游泳测试（1）旷场试验：在实验开始前1 d和实验开始后第22天，用ENV-520动物行为视频跟踪分析系统对大鼠的自发活动记录3 min并进行分析。（2）强迫游泳测试：准备水温为（25±1）℃的测试桶，分别于第1和22天预先强迫游泳15 min，24 h后再次强迫游泳5 min，并记录5 min内的不动状态时间。

1.2.3大鼠mPFC和海马中5-HT、GABA及Glu含量的检测3组大鼠在实验结束后进行断头处死，冰上分离前额叶与海马，置于液态氮中冻存后，可冷冻于-80℃冰箱待测。对所取的大鼠组织进行匀浆，并使用ELISA试剂盒测定大鼠mPFC和海马中5-HT、GABA及Glu的含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4Western印迹法检测大鼠mPFC和海马组织TLR4的蛋白表达将大鼠的mPFC和海马组织分别置于研钵中，加入一定体积的蛋白裂解液对组织进行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4℃下、12 000×g离心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量。

选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20 μL蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液进行封闭2 h后，一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗（1∶4 000）室温孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化学发光法对蛋白进行显色，应用Image J软件进行定量分析。

1.3统计学方法本研究用SPSS 21.0统计软件。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1自发活动与强迫游泳不动时间如表1所示，造模前，各组大鼠自发活动总路程差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结束后，与正常对照组相比，模型组大鼠自发活动总路程减少（P＜0.01），强迫游泳不动时间延长（P＜0.01）。与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠自发活动总路程增加（P＜0.01），强迫游泳不动时间缩短（P＜0.01），而与正常对照组相比无差异（P＞0.05）。

表1 自发活动与强迫游泳不动时间Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

表1 自发活动与强迫游泳不动时间Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

注:与正常对照组相比，**P＜0.05；与模型组相比，##P＜0.05

组别正常对照组模型组TAK-242治疗组P值只数10 10 10-自发活动总路程（cm）造模前304.64±107.45 313.73±114.23 312.23±79.25＜0.05造模后499.43±128.14 127.24±37.17**413.85±118.32##＜0.05强迫游泳不动时间（s）93.23±10.44 131.64±17.45**183.23±11.43##＜0.05

2.2各组大鼠mPFC和海马中5-HT的含量如表2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠mPFC和海马中5-HT的含量均降低（P＜0.01）；与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠mPFC和海马中5-HT的含量均升高（P＜0.01）。说明TAK-242治疗大鼠后，可提高大鼠mPFC和海马中5-HT的含量。

2.3各组大鼠mPFC和海马中GABA的含量如表3所示，与正常对照组相比，模型组大鼠mPFC和海马中GABA的含量均显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠mPFC和海马中GABA的含量均显著升高（P＜0.01）。说明TAK-242治疗大鼠后，可提高大鼠mPFC和海马中GABA的含量。

表2 各组大鼠大鼠mPFC和海马中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表2 各组大鼠大鼠mPFC和海马中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：与正常对照组相比，**P＜0.05；与模型组相比，##P＜0.05

组别正常对照组模型组TAK-242治疗组P值只数10 10 10-5-HT含量（μmol/L）mPFC 1.23±0.14 0.64±0.12**1.23±0.11##＜0.05海马1.64±0.25 0.93±0.13**1.33±0.09##＜0.05

表3 各组大鼠大鼠mPFC和海马中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表3 各组大鼠大鼠mPFC和海马中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：与正常对照组相比，**P＜0.05；与模型组相比，##P＜0.05

组别正常对照组模型组TAK-242治疗组P值只数10 10 10-GABA含量（μmol/L）mPFC 58.21±16.13 37.62±13.13**73.22±18.12##＜0.05海马154.61±35.21 52.95±15.15**213.33±44.02##＜0.05

2.4各组大鼠mPFC和海马中Glu的含量如表4所示，与正常对照组相比，模型组大鼠mPFC和海马中Glu的含量均升高（P＜0.01）；与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠mPFC和海马中Glu的含量均降低（P＜0.01）。这说明TAK-242治疗大鼠后，可减低大鼠mPFC和海马中Glu的含量。

表4 各组大鼠大鼠mPFC和海马中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表4 各组大鼠大鼠mPFC和海马中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：与正常对照组相比，**P＜0.05；与模型组相比，##P＜0.05

组别正常对照组模型组TAK-242治疗组P值只数10 10 10-Glu含量（μmol/L）mPFC 21.22±6.15 39.63±9.18**27.26±8.42##＜0.05海马27.64±7.53 56.93±12.14**30.37±9.47##＜0.05

2.5各组大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比较如图1所示，与正常对照组相比，模型组大鼠mPFC中TLR4蛋白的表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠mPFC中TLR4蛋白的表达量显著下调（P＜0.01）。说明TAK-242治疗大鼠后，可下调大鼠mPFC中TLR4蛋白的表达量。

图1 各组大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比较Fig.1 Comparison of TLR4 protein content in mPFC of rats in each group

2.6 各组大鼠海马中TLR4蛋白含量的比较如图2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠海马中TLR4蛋白的表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，TAK-242治疗组大鼠海马中TLR4蛋白的表达量显著下调（P＜0.01）。说明TAK-242治疗大鼠后，可下调大鼠海马中TLR4蛋白的表达量。

图2 各组大鼠海马中TLR4蛋白含量的比较Fig.2 Comparison of TLR4 protein contents in hippocampus of rats in each group

3 讨论

抑郁症已成为临床上较难治愈的病症，长期轻度不可预见性应激（CUMS）是导致抑郁症发病的主要因素［12］。CUMS建立的大鼠抑郁症模型能很好地模拟抑郁症的某些症状和病因，因此，本研究采用CUMS加孤养建立大鼠抑郁症模型，初步研究Toll样受体4拮抗剂厄立特兰（TAK-242）对抑郁症大鼠模型前额叶（mPFC）和海马神经元发生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影响。本研究证实，抑郁症模型大鼠的自发运动比正常组减少，强迫游泳不动时间延长，即模型组大鼠的运动能力有所下降，正处于抑郁症发病状态，这证实抑郁症大鼠模型建模成功。

抑郁症的发生与脑内单胺递质5-HT的缺乏有着密切相关［13］。本研究结果证实，与正常对照组相比，抑郁症大鼠mPFC和海马中的5-HT显著降低，而TAK-242治疗组与模型组相比，大鼠mPFC和海马中5-HT的含量均显著升高，这说明抑郁症模型大鼠的发病与脑内单胺递质5-HT的表达量低有关，同时Toll样受体4拮抗剂TAK-242可以提高大鼠mPFC和海马中5-HT的表达量，对抑郁症有缓解作用。

抑郁症的发生不仅与5-HT的表达降低有关，还与GABA和Glu有关联。在抑郁症的发病机制中，5-HT、Glu和GABA在情感障碍发病中发挥关键作用。Glu是海马内的重要兴奋性递质，其与学习记忆和情绪控制关系密切［14-15］。GABA参与脑内胺类、肽类和氨基酸类神经递质的调控功能，抑郁症患者脑组织中GABA浓度较正常对照显著下调，Glu浓度显著上升，说明抑郁患者大脑GABA和Glu浓度失衡，大脑神经传递受损［16］。本研究表明，大鼠mPFC和海马中Glu含量上升，GABA含量降低；而TAK-242治疗组与模型组相比，大鼠mPFC和海马中Glu含量降低，GABA含量显著升高。Toll样受体4拮抗剂TAK-242可提高GABA含量，降低Glu含量，够使抑制性氨基酸与兴奋性氨基酸趋于平衡，有利于恢复抑郁症患者的正常情绪和认知功能，这可能是抑郁症得到缓解的机制之一。

TLR4是Toll样受体家族的I型膜受体，不仅能够识别外源性配体，还能够识别内源性配体，因此可被神经损伤部位的内源性配体激活［17］。TLR4在中枢神经系统疾病中发挥着重要的功能，参与脑组织损伤后的炎症反应，包括帕金森病、阿尔茨海默病以及肌萎缩侧索硬化等神经变性疾病［18-20］。本研究结果显示，大鼠mPFC和海马中TLR4的蛋白与正常对照组相比表达量上调，而TAK-242治疗组与模型组相比，大鼠mPFC和海马中TLR4的蛋白表达量下调。这说明TAK-242注射抑郁症模型大鼠后，能够使大鼠mPFC和海马中TLR4的蛋白表达量下调，推测TLR4通路与抑郁症大鼠模型前额叶和海马神经元发生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡有关。

本研究的新颖之处在于采用Toll样受体4拮抗剂厄立特兰（TAK-242）作用于抑郁症大鼠模型，同时测量前额叶和海马神经元发生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡，从而可以全面评价Toll样受体4拮抗剂厄立特兰（TAK-242）治疗抑郁症的效果和机制。本研究的不足是没有评估在该过程中神经递质的变化，这也是本课题组下一步研究的方向，即采用微透析技术探究厄立特兰（TAK-242）治疗抑郁症时各脑区神经递质的变化。

综上所述，TLR4抑制剂TAK-242对SD小鼠抑郁症具有缓解作用，其作用包括改善大鼠的自发运动能力、提高5-HT的含量、控制γ-氨基丁酸和谷氨酸的平衡以及降低TLR4的蛋白表达量。推测TAK-242的抑郁症缓解作用可能与抑制炎症反应有关。本研究为抑郁症提供了新的治疗思路，并为深入探讨TAK-242的抑郁症缓解机制（即抗炎分子机制）奠定基础。