表面活性蛋白D缓解脓毒症诱发的急性肾损伤的机制

梁景云 伍松姣 徐文丽 潘可学 王小芳

1广西中医药大学附属瑞康医院（南宁 530001）；2梧州市人民医院（广西梧州 543000）

脓毒症是感染因素所致的全身炎症反应综合征［1］。细胞凋亡在诸如炎症反应等多个病理环节中发挥重要的调节功能；内毒素能够诱发炎症介质释放并启动级联反应，诱导细胞凋亡。当细胞面临缺血缺氧、细菌感染等状态时，可促使核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）被激活并移至细胞内，与NF-κB特异性DNA位点结合，发挥转录调控功能。炎性因子的表达会受到NF-κB调控影响。NF-κB所介导的炎性反应与诱发急性缺血性肾损伤密切相关［2-3］。肾小管上皮细胞屏障损伤是急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的特征。血清表面活性蛋白D（surface active protein D，SP-D）能促进免疫系统对致病原的清除，可抑制炎性因子的释放和淋巴细胞的增生。AKI SP-D 11thr/苏氨酸基因型患者容易发生AKI，其机制与血清中SP-D水平相关［4-6］。SP-D可清除侵入肺部病原体，避免因炎症反应加剧和组织损伤［7-8］。本研究探究SP-D缓解脓毒症通过调节细胞凋亡和NF-κB介导的炎症诱发AKI机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物鼠龄8～10周的野生型C57BL/6雄性小鼠：购自美国Jackson实验室；鼠龄8～10周的SP-A/D KO雄性小鼠：由美国加利福尼亚大学的Hawgood教授的实验室提供。体质量20～25 g。

1.1.2试剂戊巴比妥钠（榕柏生物技术有限公司，上海）；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的ELISA试剂盒（吉泰依科赛生物科技有限公司，上海）；NF-κB抗体（Uene Tex，美国）。

1.2方法

1.2.1分组C57BL/6小鼠144只，分4组（n=36）：SP-D 敲除组（KO）、SP-D 野生组（WT），两组均设置手术组（Sepsis）和假手术组（Sham），即WT sham组、KO sham组、WT sepsis组、KO sepsis组，假手术组为对照组。小鼠术前12 h禁饮食、麻醉。手术组小鼠进行盲肠结扎穿刺术：备皮，腹正中切口1.5 cm，取出盲肠，在回盲瓣以下0.5 cm处用4号丝线环扎盲肠，用12号针头在回盲端顶部穿刺贯通，挤压粪便后将盲肠还纳，逐层缝合。假手术组小鼠不进行盲肠环扎及穿孔，余同手术组。

1.2.2取材小鼠盲肠结扎穿刺术后6及24 h，摘除单侧眼球取血清0.7～1 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液入EP管置于-80℃冰箱。剪断腹主动脉放血，结扎剖取双侧肾脏组织置于-80℃。

1.2.3血清中TNF-α及MCP-1测定用ELISA测模型建立后6及24 h血清TNF-α和MCP-1含量，测定按照试剂盒说明进行。

1.2.4凋亡细胞检测根据酶溶解组织提取细胞的方法取材。用钙结合蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）双染色法和流式细胞仪测定组织凋亡细胞。

1.2.5肾脏组织中NF-κB和SP-D的测定ELISA法测定肾脏组织中NF-κB水平，Western blot法测定NF-κB和SP-D在肾脏组织的表达。

1.2.6TUNEL检测小鼠肾脏用10%的甲醛进固定，石蜡包埋，经肾门纵向4 μm厚连续切片6张，用TUNEL法检测凋亡。

1.3统计学方法计量资料用均数±标准差表示，组间比较用方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义，用SPSS 19.0软件行统计分析。

2 结果

2.1不同时间点血清TNF-α水平术后6 h WT sepsis组和KO sepsis组血清TNF-α水平高于对照组（P＜0.05），且KO sepsis组TNF-α水平高于WT sepsis组（P＜0.05）；术后24 h WT sham组与KO sham组小鼠血清TNF-α水平差异无统计学意义（P＜0.05），WT sepsis组和KO sepsis组血清TNF-α水平高于对照组（P＜0.05），且KO sepsis组TNF-α水平高于WT sepsis组（P＜0.05）；术后 24 h WT sepsis组及KO sepsis组的TNF-α水平高于术后6 h（P＜0.05）。见表1。

表1 不同时间点血清TNF-α水平Tab.1 TNF-α levels at different time points ± s，pg/mL

表1 不同时间点血清TNF-α水平Tab.1 TNF-α levels at different time points ± s，pg/mL

注：与WT sham组比较，*P＜0.05；与KO sham组比较，△P＜0.05；与WT sepsis组比较，#P＜0.05

时间点6 h 24 h P值WT sham组362.8±14.8 355.1±14.0＞0.05 KO sham组364.0±18.4 364.4±17.1＞0.05 WT sepsis组604.6±24.6*874.6±41.0*＜0.05 KO sepsis组808.9 ± 40.8△#1 239.0 ± 58.1△#＜0.05

2.2 不同时间点血清MCP-1水平术后6 h WT sepsis组和KO sepsis组血清MCP-1水平高于对照组（P＜0.05），且KO sepsis组MCP-1水平高于WT sepsis组（P＜0.05）；术后24 h WT sepsis组和KO sepsis组血清MCP-1水平高于对照组（P＜0.05），且KO sepsis组MCP-1水平高于WT sepsis组（P＜0.05）；术后 24 h WT sepsis组及 KO sepsis组的MCP-1水平高于术后6 h（P＜0.05）。见表2。

表2 不同时间点血清MCP-1水平Tab.2 MCP-1 levels at different time points ±s，pg/mL

表2 不同时间点血清MCP-1水平Tab.2 MCP-1 levels at different time points ±s，pg/mL

注：与WT sham组比较，*P＜0.05；与KO sham组比较，△P＜0.05；与WT sepsis组比较，#P＜0.05

时间点6 h 24 h P值WT sham组45.4±1.9 46.7±1.8＞0.05 KO sham组47.3±2.4 48.6±2.3＞0.05 WT sepsis组67.2±2.7*99.5±4.7*＜0.05 KO sepsis组91.9 ± 4.6△#165.2 ± 7.7△#＜0.05

2.3 脓毒症小鼠肾脏组织中SP-D表达的变化在WT小鼠的肾脏中发现SP-D的表达，使用肺作为阳性SP-D KO对照并且SP-D KO小鼠肾脏作为阴性对照，术后6和24 h SP-D表达降低（P＜0.05）。见图1、2。

2.4 肾脏细胞凋亡脓毒症的肾脏中可见棕色核的凋亡细胞，与脓毒症建模后24 h的WT小鼠相比，来自脓毒性SP-D KO小鼠的肾脏中TUNEL阳性细胞数目高（P＜0.05）。见图3、4。

2.5 肾脏NF-κB水平变化在脓毒症造模后6和24 h，脓毒症小鼠中NF-κB的水平增加（P＜0.05）。脓毒性SP-D KO小鼠的肾脏中NF-κB的水平高（P＜0.05）。见表3和图5。

3 讨论

脓毒症诱发AKI的本质是大量炎症细胞和炎症因子导致的过度失控性的炎性反应［9-10］。中性粒细胞、巨噬细胞在内毒素作用下，产生TNF-α、白介素等促炎因子，启动炎性反应的级联反应［11］。内毒素血症是AKI发病的始动核心环节［12］。

图1 脓毒症小鼠肾脏组织中SP-D表达的变化Fig.1 The changes of SP-D expression in renal tissue of septic mice

图2 脓毒症小鼠肾脏组织中SP-D表达的变化（Western blot）Fig.2 The changes of SP-D expression in renal tissue of septic mice（Western blot）

图3 SP-D KO和WT脓毒症小鼠的肾脏细胞凋亡情况Fig.3 Renal cell apoptosis in septic mice with SP-D KO and WT

图4 SP-D KO和WT脓毒症小鼠的肾脏细胞凋亡情况Fig.4 Renal cell apoptosis in septic mice with SP-D KO and WT（TUNEL × 200）

表3 肾脏NF-κB表达变化Tab.3 The changes of NF-kappa B level in kidney of SP-D KO and WT sepsis mice ± s

表3 肾脏NF-κB表达变化Tab.3 The changes of NF-kappa B level in kidney of SP-D KO and WT sepsis mice ± s

注：与Sham组比较，*P＜0.05；与 6 h组比较，#P＜0.05

分组WT KO P值Sham 0.14±0.07 0.20±0.07＞0.05 6 h 0.26±0.10*0.67±0.18*＜0.05 24 h 0.82±0.16*#0.94±0.20*#＜0.05

图5 肾脏NF-κB表达变化Fig.5 The changes of NF-kappa B expression in kidney（Western Blot）

炎性介质和氧自由基通过引发细胞膜脂质过氧化导致生物膜损伤，引起细胞坏死和凋亡［13］。NF-κB作为核转录因子，通过与B细胞免疫球蛋白的轻链K链基因增强子序列结合，调节靶基因表达，引起多种炎性介质和细胞因子释放，因此NF-κB通路在机体炎症反应过程中起核心作用。故抑制NF-κB信号转导路径能够减轻脓毒症诱发AKI的炎症反应，对盲肠结扎穿孔的脓毒症小鼠的研究表明受累的肺组织中SP-D表达增高。

本研究中，建模术后6 h血清TNF-α和MCP-1水平升高，WT小鼠和SP-D KO小鼠在24 h血清TNF-α和MCP-1水平增加，与脓毒症SP-D KO相比WT小鼠具有更高的缓解感染的活性。在术后24 h脓毒症WT和KO小鼠凋亡细胞的定量分析结果显示来自脓毒性SP-D KO小鼠的肾脏中TUNEL阳性细胞的数目更高。在脓毒症造模后，脓毒症小鼠中NF-κB的水平显着增加，来自脓毒性SP-D KO小鼠的肾脏中的NF-κB的水平与WT小鼠相比更高。肾脏中SP-D水平的降低进一步减弱了SP-D在机体防御和抗炎调节以及细胞凋亡中的保护作用。这是因为SP-D在机体防御和先天性免疫方面发挥重要作用，其具有胶原结合区域，其基于钙网蛋白-CD91复合物可发挥其抗炎作用，有助于减少暴露于病原体、过敏原而诱发的凋亡。

综上所述，在脓毒症诱发AKI模型中SP-D在肾脏中的表达增加后能够通过降低血清中的促炎细胞因子产生和MCP-1活性，并通过抑制NF-κB的活性和细胞凋亡减轻了脓毒症诱导的AKI而发挥保护作用。