p38MAPK在ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤中的作用研究

郝丹，周大亮，于熙滢，张春茹，魏林

动脉粥样硬化是心血管系统疾病发生的基础，随着人民生活水平的不断提高，动脉粥样硬化的发病率有增加的趋势，动脉粥样硬化发生机制中内皮细胞损伤、脂质浸润、血栓的形成等均参与其中，而血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的开始[1,2]。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是损伤血管内皮细胞的重要因素，参与动脉粥样硬化发生的整个过程，在体外用ox-LDL处理血管内皮细胞是常用的在体外研究动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤的模型[3]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是一个重要的信号转导通路，在细胞的生长、凋亡等过程中具有重要作用，并且在脑缺血再灌注、糖尿病、癌症等疾病发生中有调控功能[4-6]。研究显示，p38MAPK在大鼠动脉粥样硬化斑块组织中过度磷酸化，并且在血管内皮细胞中发现有p38MAPK的表达[7]。本实验拟通过体外构建ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤模型，用p38MAPK抑制剂处理细胞，探讨p38MAPK在ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤中的作用，以期为明确动脉粥样硬化发病机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料人脐带静脉血管内皮细胞HUVEC-12为美国ATCC产品；p38MAPK抑制剂SB203580、ox-LDL为美国Sigma产品；乳酸脱氢酶（LDH）含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）含量测定试剂盒、丙二醛（MDA）含量测定试剂盒均为南京建成研究所产品；山羊抗兔IgG为北京中杉产品；兔抗p38MAPK抗体、兔抗剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）抗体为美国Santa Cruz产品；兔抗p-p38MAPK抗体、兔抗β-actin抗体为美国Novus产品；0.25%胰蛋白酶消化液为美国Gibco产品；膜联蛋白 V-FITC/碘化丙啶（PI）双染细胞凋亡检测试剂盒为上海优宁维产品；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo；一氧化氮（NO）含量测定试剂盒为北京索莱宝产品；细胞间黏附分子-1（ICAM-1）含量测定试剂盒、白细胞介素-1β（IL-1β）含量测定试剂盒为上海康朗生物产品。

1.2 细胞分组及培养人脐带静脉血管内皮细胞HUVEC-12复苏以后，添加10%胎牛血清的DMEM配制成细胞悬浮液，种植到细胞培养瓶中，在5% CO2培养箱（37℃）中培养约3 d以后，细胞汇合度超过80%。用0.25%的胰蛋白酶消化传代以后，用于后续实验研究。HUVEC-12细胞分为对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组，其中ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组在实验时在各组细胞培养液中添加

100 μg/ml的ox-LDL，同时实验1组、实验2组、实验3组细胞分别先用5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L p38MAPK抑制剂SB203580预处理24 h以后再添加100 μg/ml的ox-LDL的培养液继续培养24 h。各组细胞在分别孵育24 h以后，进行实验检测。对照组细胞不做任何处理，正常培养。

1.3 Western blot测定各组细胞中p38MAPK磷酸化水平将对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组细胞中的上清吸除以后，在每组血管内皮细胞中添加PBS洗涤2次以后，加入含有1% 苯甲基磺酞氟（PMSF）的裂解液，把细胞放在冰上，孵育30 min以后，以12000 g，4℃离心20 min。取上清溶液，保存在-20℃。用BCA法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。配制蛋白凝胶，在上样前在蛋白样品中添加等体积的上样缓冲液，用沸水煮沸反应5 min。取出凝胶，用30 mA电流电转，把凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜后用5%牛血清白蛋白在室温中封闭1 h。再把膜放在含有1:600稀释的p38MAPK、p-p38MAPK中，放在4℃过夜后取出。再把膜放在含有1:3000稀释的二抗溶液中，在室温中孵育结合2 h。按照说明书配制ECL发光液，化学发光后，曝光后，Image J分析条带灰度值。

1.4 二硝基苯肼法、硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化法分别测定培养液上清中LDH、MDA和匀浆液中SOD含量取对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组细胞和培养液上清，分别测定培养液上清中LDH、MDA含量及细胞匀浆液中SOD水平，具体的操作步骤分别参照试剂盒说明书。二硝基苯肼法测定培养液中LDH水平：LDH可以将乳酸催化生成丙酮酸，而丙酮酸可以与2，4-二硝基苯肼结合产生丙酮酸二硝基苯腙，丙酮酸二硝基苯腙在碱性环境中呈现棕红色，根据比色法计算出LDH的活性。黄嘌呤氧化法测定匀浆液中SOD活性：黄嘌呤氧化酶系统产生大量的超氧阴离子自由基，而SOD能够抑制超氧阴离子自由基的产生，超氧阴离子自由基可以形成亚硝酸盐，亚硝酸盐在经过显色剂作用以后呈现紫红色，测定其吸光度可间接反应SOD的活力。硫代巴比妥酸法测定培养液中MDA水平：脂质过氧化可以产生大量的MDA，而MDA与硫代巴比妥酸结合后产生红色的产物，检测其在532 nm的吸收峰可以间接计算出MDA含量。

1.5 流式细胞术测定细胞凋亡取对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组细胞，加入胰蛋白酶消化以后，用PBS把各组血管内皮细胞悬浮以后，计数。取适量的细胞悬浮液（约含有106个细胞），1000 g离心10 min，把上清溶液吸除以后，再添加200 μl的Annexin V-FITC的结合缓冲液混匀以后，添加5 μl的Annexin V-FITC和PI，用流式细胞仪测定各组血管内皮细胞凋亡情况。同时收集各组细胞，用Western blot法测定各组细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平，以β-actin为内参，步骤同上。

1.6 比色法测定培养液中NO含量NO释放以后可以变成NO2-和NO3-，而镉粉可以把NO3-还原成NO2-，NO2-能够同Griess反应产生有色的化合物，用分光光度计测定其在540 nm的吸光度，根据吸光度计算NO2-含量可以间接反应NO水平。取对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组细胞培养液，按照试剂盒步骤操作检测NO含量。

1.7 ELISA法测定培养液中ICAM-1、IL-1β含量取对照组、ox-LDL组、实验1组、实验2组、实验3组细胞培养液上清，用ELISA法测定培养液上清中ICAM-1、IL-1β含量，步骤参照各试剂盒说明书。

1.8 统计学分析所得的实验数据均用软件SPSS 21.0进行统计分析，计量资料以平均数±标准差（x±s）表示，多组差异的比较用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p38MAPK抑制剂降低ox-LDL作用后的血管内皮细胞中p38MAPK磷酸化水平ox-LDL组细胞中的p38MAPK蛋白磷酸化水平高于对照组（P＜0.05）。ox-LDL诱导血管内皮细胞中p38MAPK蛋白磷酸化。而用p38MAPK抑制剂处理以后，各组细胞中的p38MAPK蛋白磷酸化水平均低于ox-LDL组（P＜0.05），并且随着p38MAPK抑制剂作用浓度的升高，细胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平降低（表1，图1）。

2.2 p38MAPK抑制剂降低ox-LDL作用后的血管内皮细胞氧化损伤ox-LDL组细胞培养液中LDH、MDA水平高于对照组（P＜0.05），而细胞匀浆液中SOD水平低于对照组（P＜0.05）。ox-LDL诱导血管内皮细胞氧化损伤。而用p38MAPK抑制剂处理以后，各组细胞培养液中LDH、MDA水平均低于ox-LDL组，匀浆液中SOD水平高于ox-LDL组（P＜0.05），并且随着p38MAPK抑制剂作用浓度的升高细胞培养液中LDH、MDA水平逐渐降低，匀浆液中的SOD水平逐渐升高（表2）。

2.3 p38MAPK抑制剂降低ox-LDL作用后的血管内皮细胞凋亡水平ox-LDL组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平高于对照组（P＜0.05）（图2、表3）。ox-LDL诱导血管内皮细胞凋亡。而用p38MAPK抑制剂处理以后，各组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平均低于ox-LDL组（P＜0.05），且随p38MAPK抑制剂作用浓度的升高细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平逐渐降低（表2）。

表1 各组血管内皮细胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平（x±s）

图1 Western blot测定各组血管内皮细胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平

2.4 p38MAPK抑制剂促进ox-LDL作用后的血管内皮细胞合成NOox-LDL组细胞培养液中NO水平低于对照组（P＜0.05）。ox-LDL减少血管内皮细胞合成NO。而用p38MAPK抑制剂处理以后，各组细胞培养液中NO水平均高于ox-LDL组（P＜0.05），并且随着p38MAPK抑制剂作用浓度的升高细胞分泌的NO水平逐渐升高（表4）。

2.5 p38MAPK抑制剂减少ox-LDL作用后的血管内皮细胞分泌ICAM-1、IL-1βox-LDL组细胞培养液中ICAM-1、IL-1β水平高于对照组（P＜0.05）。ox-LDL诱导血管内皮细胞合成黏附因子ICAM-1和炎症因子IL-1β。而用p38MAPK抑制剂处理以后，各组细胞培养液中ICAM-1、IL-1β水平均低于ox-LDL组（P＜0.05），并且随着p38MAPK抑制剂作用浓度的升高细胞分泌的ICAM-1、IL-1β水平逐渐降低（表5）。

表2 各组血管内皮细胞培养液中LDH、MDA和匀浆液中SOD水平（x±s）

图2 各组血管内皮细胞凋亡及Cleaved Caspase-3水平检测

表3 各组血管内皮细胞凋亡及Cleaved Caspase-3水平（x±s）

3 讨论

动脉粥样硬化的发生是一种发生于动脉组织的慢性疾病，高血压、吸烟、肥胖等都是其发生的危险因素，血管内皮细胞功能损伤是动脉粥样硬化发生的早期表现[8]。血管内皮细胞具有强大的内分泌功能，其具有传递信号、调节血管张力、调控血管壁的通透性、维持凝血功能等多种生物学作用[9]。ox-LDL作为一种重要的血管内皮损伤因子，其表达水平升高后可以促进动脉粥样硬化的发生，ox-LDL可促进血管内皮细胞氧化损伤，诱导血管内皮细胞凋亡，是一种常用的体外研究动脉粥样硬化的诱导因子[10,11]。

表4 各组血管内皮细胞培养液中NO含量（x±s）

表5 各组血管内皮细胞分泌的 ICAM-1、IL-1β水平（x±s）

p38MAPK是MAPK的一员，在血管内皮细胞损伤中具有重要作用。研究显示，在血管内皮细胞受到过氧化氢刺激以后，细胞中的p38MAPK磷酸化水平升高，用杜鹃素处理后可减少血管内皮细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，减弱p38MAPK的磷酸化[12]。在研究脑中风血管内皮细胞中发现，缺氧再灌注可以激活p38MAPK信号通路诱导细胞凋亡的发生[13]。近年来的研究表明，p38MAPK在动脉粥样硬化中过度激活，用ox-LDL处理可诱导细胞内p38MAPK的过度磷酸化[14,15]。本实验结果表明，ox-LDL处理以后的血管内皮细胞中p38MAPK磷酸化增多，这与上述实验报道相符合。同时本实验还表明，p38MAPK抑制剂预处理以后的血管内皮细胞经ox-LDL诱导后，细胞凋亡水平有所下降，细胞中凋亡执行因子Caspase-3的活化水平降低，说明抑制p38MAPK可以减弱ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡。

ox-LDL在动脉粥样硬化组织中大量聚集，其可以促进内皮细胞中合成NO的酶移位，减少NO的合成和释放，NO是一种血管舒张因子，能够维持血管内皮的完整性，其可以抵抗血栓的形成、减少血小板聚集，同时NO还具有阻碍内皮细胞同单核细胞之间黏附的功能[16-18]。ICAM-1存在于血管内皮细胞、白细胞、上皮细胞等多种细胞的表面，其可以促进单核细胞与内皮细胞的黏附和迁移，是促动脉粥样硬化发生因子[19]。MDA是脂质发生过氧化以后产生的一种分解产物，是常见的检测脂质过氧化程度的一种指标[20]。SOD是唯一一个能够特异性的清除体内氧自由基的金属酶分子，其可以维持机体内的氧自由基的平衡，而氧自由基可以诱导血管内皮细胞损伤，是重要的抗动脉粥样硬化发生的因子之一[21,22]。LDH原本存在于内皮细胞内，在细胞受到损伤以后，细胞的通透性发生改变，使的细胞内的LDH向细胞外漏出，检测LDH释放水平可以反映出细胞膜的损伤程度[23,24]。本实验结果表明，ox-LDL处理以后的血管内皮细胞释放的LDH、MDA水平增加，而SOD水平减少，细胞合成的NO水平降低，细胞分泌的黏附因子ICAM-1和炎症因子IL-1β水平均增加，说明ox-LDL造成了血管内皮细胞氧化损伤，增加了炎症因子和黏附因子的释放，而抑制p38MAPK后的血管内皮细胞释放的LDH、MDA减少，合成NO增加，细胞分泌的黏附因子ICAM-1和炎症因子IL-1β减少，说明抑制p38MAPK可以减弱ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤，减少单核细胞和内皮细胞的黏附，减轻炎症反应。

p38MAPK在动脉粥样硬化中过度磷酸化，抑制p38MAPK可以减弱ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，减轻炎症反应，减少单核细胞和内皮细胞的黏附，发挥保护作用，这提示p38MAPK在动脉粥样硬化血管内皮损伤中具有重要作用，在以后的实验中会对其具体的机制进行探讨。