eNOS基因T786-C和4b/a多态性与中国人群冠心病风险相关性的Meta分析

马琳璐，李柄辉，郭娇，赵明娟，翁鸿，刘新灿

我国心血管疾病现患人数高达2.9亿，死亡率占城乡居民总死亡原因的首位，占居民疾病死亡构成的40%以上[1]，而其中冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD），高发病率和致死率，已严重威胁人类健康[2]。随着基因探测技术的发展，CAD认为是一组复杂的、多基因与环境相互作用的疾病[3-5]。研究表明多种基因突变可以增加CAD风险，其中以一氧化氮合酶家族表皮型一氧化氮合酶基因（eNOS）关系最密切[6,7]。

当eNOS基因位点发生突变，如eNOS基因启动子区T786-C位点，胸腺嘧啶(T)被等位基因胞嘧啶(C)所取代；4号内含子处的27个碱基发生5次重复（记录为4b），少数变异发生4次重复（记录为4a），会导致eNOS蛋白结构、生物活性改变，引起血液中NO浓度的改变，促进动脉粥样硬化的发生，进而诱发CAD。目前，已有多项研究发现，T786-C和4b/a多态性与CAD的发生发展有关[8,9]。然而Ragia等[10]研究表明eNOST786-C与CAD发病风险并无关联，Sigusch等[11]指出在德国人群中并未发现4b/a多态性与CAD的关系。由于不同国家地区人群基因频率的差异，国人eNOS基因T786C和4b/a位点多态性与CAD的风险尚未得到全面地评价。因此，本研究拟采用Meta分析的方法，遵照PRISMA报告规范[12]，对国内外已发表的关于eNOS基因T786C和4b/a多态性与中国人群CAD发病相关性进行研究，以期得出较为客观的结论。

1 资料与方法

1.1 文献纳入排除标准所纳入的研究符合以下标准：①主题为研究eNOS基因T786-C和/或4b/a位点多态性与中国人群冠心病相关性，冠心病有明确的诊断标准（冠状动脉造影示：至少一支冠状动脉血管狭窄≥50%；或符合WHO缺血型冠心病诊断标准）；②直接报道了或者报道的数据能够估算出优势比（OR）及其95%可信区间（CI）；③研究设计为病例-对照研究；④重复发表或数据相同的研究，按照Little等[13]推荐的方法选择方法学质量更高、数据更全的研究。文献排除标准：①非中、英文文献；②对照组为非健康对照者。

1.2 文献检索由两名作者独立检索公开发表的研究，并交叉核对，遇有争议则第3位作者介入并通过讨论达成一致。以检索式(“endothelial nitric oxide synthase” OR “eNOS”OR “NOS3”OR“ECNOS”) AND (“polymorphism” OR“genetic”OR “mutation” OR “variant”) AND(“coronary atherosclerotic heart disease”OR“coronary heart disease” OR “coronary artery disease” OR“myocardial infarction”)计算机检索PubMed、Embase，以中文主题词“冠心病、心肌梗塞、心肌梗死、内皮型一氧化氮合酶”检索CNKI、万方和VIP数据库，检索时间均为建库至2017年10月10日（更新检索于2017年11月13日）。同时，手检纳入研究的参考文献，以防漏检。

1.3 资料提取资料提取由两名作者独立进行资料，内容包括第一作者的姓名和发表年代，研究的地点，种族和基因分布位点，校正OR值及95%CI，校正因素等。提取完毕后交叉核对，并通过讨论解决分歧。

1.4 质量评价方法学质量评价采用专用于病例-对照研究的纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle -Ottawa Scale，NOS）[14]，包括研究人群的选择、组间可比性和暴露因素的测量3个方面共8个条目，组间可比性为2分，其余均为1分，共9分。

1.5 统计分析采用RevMan 5.3软件对基因模型进行Meta分析。用卡方检验对照组基因型是否符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）。采用I2和Q检验来检验异质性，若研究间同质性好（P＞0.1且I2＜50%）选择固定效应模型，反之更换为随机效应模型。并根据可能导致异质性的原因（种族，是否满足HWE平衡[15]等）进行亚组分析。排除对照组不符合HWE的研究进行敏感性分析，验证结果的稳定性。效应量采用OR及其95%CI描述，以α=0.05为Meta分析的检验水准，对于校正后的数据，根据所报告的遗传模型直接合并相关的ORs和95%的CIs。用漏斗图检测是否存在发表偏倚。本研究分析的模型包括：等位基因模型、纯合子模型、杂合子模型、显性模型和隐性模型。

2 结果

2.1 文献检索结果初检文献1147篇，经筛选最终纳入14篇文献共18个病例-对照研究[16-28]，共计4585例CAD患者，4555例健康对照人群。文献筛选流程图见图1。

2.2 纳入研究一般特征18个病例-对照研究的诊断标准明确，组间可比性好，基因检测方法合理，结果数据明确。依照NOS，纳入研究的质量均较高，为7～9分。纳入研究的一般情况及质量评价结果见表1。

2.3 Meta分析结果

图1 文献筛选流程及结果

表1 纳入研究的基本特征

2.3.1 eNOS T786-C总体人群的Meta分析结果显示，C等位基因人群CAD发病风险高于T等位基因人群（OR=1.67，95%CI：1.45～1.92），CC基因型人群CAD发病风险高于TT基因型人群（OR=2.35，95%CI：1.43～3.85）；TC基因型人群CAD发病风险高于TT基因型人群（OR=1.68，95%CI：1.44～1.97）；CC+TC基因型人群CAD发病风险高于TT基因型人群（OR=1.73，95%CI：1.49～2.02）；CC基因型人群CAD发病风险高于TC+TT基因型人群（OR=2.02，95%CI：1.23～3.30）（表3）。

2.3.2 eNOS 4b/a总体人群的Meta分析结果显示，a等位基因人群CAD发病风险高于b等位基因人群（OR=1.54，95%CI：1.34～1.77）；aa基因型人群CAD发病风险高于bb基因人群（OR=3.55，95%CI：2.15～5.86）；ab基因型人群CAD发病风险高于bb基因人群（OR=1.32，95%CI：1.12～1.55）；aa+ab基因型人群CAD发病风险高于bb基因人群（OR=1.48，95%CI：1.27～1.72）；aa基因型人群CAD发病风险高于ab+bb基因人群（OR=3.32，95%CI：2.01～5.49）（表4）。

表2 已校正混杂因素的研究信息与结果

表3 eNOS T786-C总体Meta分析及亚组分析结果

2.4 亚组分析及敏感性分析结果在eNOS T786-C多态性与国人CAD风险相关性研究中，校正OR值亚组分析，与整体人群结果相似；在eNOS4b/a多态性与国人CAD风险相关性研究中，基于种族、校正OR值的亚组分析中，该位点多样性均可增加国人CAD风险，但在校正OR值研究中，异质性较整体人群变大，可能为人群基因多态性与吸烟、高血压、血糖等因素无必要关联。基于排除对照组不符合HWE的研究进行敏感性分析的结果，两组研究均与总体人群结果相近，提示结果稳健性较好（表2～4）。

2.5 发表偏倚采用漏斗图对4b/a多样性与CAD风险研究进行发表偏倚评估（图2），漏斗图显示两侧不完全对称，表明有一部分研究未发表或存在一些灰色文献未检出，该研究存在一定的发表偏倚；受纳入研究数量影响（＜10篇），未对T786-C多样性与CAD风险研究检测，不可避免有一定的发表偏倚存在。

3 讨论

本研究综合评价了当前关于eNOS基因T786-C和4b/a 多态性与中国人群CAD发病风险的相关研究，结果表明，eNOS T786-C多态性，C等位基因人群CAD发病风险是T等位基因的1.67倍，eNOS 4b/a多态性a等位基因人群CAD发病风险是b基因型的1.54倍。本Meta分析共18个病例-对照研究，4585例CAD患者，4555例健康对照人群。在基因eNOST786-C多态性与中国人群CAD研究中，共纳入8篇文章，全为汉族人群，结果提示，T786-C多态性增加中国人群CAD发生风险。其中，有3篇校正吸烟、高血压、血糖等因素后结果显示T786-C位点改变与仍增加中国人群CAD的发病风险，与整体人群结果差别不大；另有1项研究对照组不符合HWE，敏感性分析将此研究剔除，所得结果与整体人群相似，提示本Meta分析稳健性较好。eNOS基因4b/a 多态性与中国人群CAD研究中，共纳入10篇文章，9篇汉族人群，1篇维吾尔族，结果提示，eNOS基因4b/a多态性明显增加中国人群CAD发生风险，尤其是维吾尔族人群，但少数民族纳入的文献数量少，结论需要进一步验证。其中3篇校正吸烟、高血压、血糖等因素后，显示4b/a多样性仍增加中国人群CAD发病风险，与整体人群结果差别不大。

表4 eNOS 4b/a总体Meta分析及亚组分析结果

推测eNOS基因T786-C和4b/a多态性可增加中国人群CAD风险的发生机制：位于eNOS启动子区域的T786-C其多样性可以影响eNOS表达水平，降低eNOS mRNA和NO水平；位于内含子区域的4b/a多样性，可能与eNOS基因调控区域的其他功能性变异体处于连锁不平衡状态，从而影响NO的生物利用度和活性[29]。与Ragia等[10]和Sigusch等[11]研究不同，本研究着重于探索在中国人群中eNOST786-C和4b/a多态性与CAD风险之间的关系，且研究对象一致，在一定程度上降低了相关的临床异质性。

图2 eNOS基因4b/a多样性整体人群等位基因型a/b与CAD风险研究漏斗图

本研究表明中国人群eNOS T786-C和4b/a多态性与CAD风险之间有显着的关联，但无法明确其eNOS T786-C位点多态性与eNOS 4b/a之间是否有交互作用，需要更多的原始研究来探索基因位点功能；同时本研究纳入校正混杂因素的原始研究数目较少，需要设计更多严谨的试验来进一步验证。此外，由于CAD是多基因位点突变共同参与所致，通过测定人群中特定基因位点和基因型可有效评估CAD发生风险，对临床CAD的防治具有重要的指导意义。

本研究也存在一定的局限性：①本研究为Meta分析，属于二次分析，因此本研究的质量主要取决于纳入研究的整体质量；②纳入研究的对象仅为中国人群，影响结论的外推性；③纳入研究的对照组来源多数为医院人群，可能不具有完全的代表性，因而更容易出现选择偏倚；④纳入的部分研究样本量较小，检验效能不足；⑤本Meta分析的研究间有中度的异质性，可能会降低本研究结论的可信度。

综上所述，本Meta分析的结果表明，eNOS基因T786-C和4b/a多态性皆会增加中国人群CAD发病风险，受纳入研究的数量与质量限制，上述结论尚需更多大样本高质量研究予以验证。