白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠心肌保护及Akt/JNK3/caspase-3信号通路的影响

何忠开，郑玉菡，姚峰，郑重洲，陈灿，李波

急性心肌梗死（AMI）是常见的心血管疾病，具有发病率高和致死率高的特点[1]。近年来，随着饮食结构和生活方式的改变，AMI的发病率逐年攀升，严重威胁患者身体健康和生命安全。目前，临床治疗AMI以手术和药物辅助治疗为主，介入术和溶栓治疗在治疗AMI方面取得一定的疗效，但是介入术后再狭窄现象表明，介入术和溶栓药物不能从根本上抑制AMI的发病。因此，采取安全、高效的药物治疗AMI是医学工作者研究的热点问题。AMI的主要病理表现为心肌细胞氧化损伤和炎症反应，重则引起心肌细胞凋亡，进而引发心力衰竭[2,3]。白藜芦醇（Res）是一种重要的植物抗毒素，具有抗肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎的作用[4]。早期研究表明，Res能改善AMI大鼠心肌重构及减少心律失常[5,6]。然而，Res对AMI大鼠心肌保护作用的具体作用机制尚未完全明确，本文通过实验验证Res对AMI大鼠的心肌保护作用，以及对Akt/JNK3/caspase-3信号通路的影响，初步探讨其发挥作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲料SPF级雄性SD大鼠60只，8～10周龄，体重200±20 g，购自广东医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK（粤）2016-0002]。

1.1.2 主要材料与仪器Res（生产批号：111535-201703）和法舒地尔（生产批号：100614-201603）均购自中国药品生物制品鉴定所；兔抗鼠p-Akt、p-JNK3、caspase-3多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 AMI模型建立及鉴定根据文献资料制备AMI模型[7]。术前将大鼠称重，按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠将大鼠麻醉，将大鼠进行消毒、剪毛，行气管插管并连接小动物呼吸机辅助呼吸；于大鼠第3、4肋骨间剪开皮肤、肌肉及筋膜，打开大鼠胸腔，暴露心脏，在体视显微镜下用4号线结扎前降支，假手术组（10只）只穿线不结扎，手术结束后缝合大鼠胸腔及皮肤。造模24 h后，检测假手术组和模型组的心电图。

1.2.2 动物分组及给药处理将AMI模型大鼠随机分成5组，每组10只，分别命名为模型组、法舒地尔组、Res低剂量组、Res中剂量组、Res高剂量组。法舒地尔组：在模型组的基础上，给予30 mg/kg法舒地尔[7]； Res低、中、高剂量组：在模型组的基础上，分别给予10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg Res[8]。所有大鼠均行灌胃治疗，1/d，持续治疗2周，假手术组及模型组给予等容积生理盐水。

1.2.3 Res对大鼠血清中各项生化指标的观察采集各组大鼠腹主动脉血，离心后收集血清。用ELISA试剂盒检测血清中SOD、CK、CK-MB、TnI、MDA的活性，并检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 TTC染色检测心肌梗死面积将大鼠麻醉后，进行剪毛和消毒处理，于无菌超净台内打开大鼠胸腔，用10%的甲醛溶液经主动脉灌注心脏，固定30 min左右，摘除心脏，置于预冷的PBS溶液中，每组取3只大鼠心脏去除右心房和右心室，用吸水纸吸干剩余组织表面的水分，置于-20℃存放20 min，然后由心尖部向心底部制作连续切片（厚度2 mm），将切片置于37℃孵育，1%的TTC溶液染色20 min，存活心肌组织染成红色，梗死心肌组织染成灰白色。染色结束后用自来水冲去浮色，吸水纸吸走多余的水分，用Image master图像分析仪分析心肌梗死面积百分比。

1.2.5 HE染色检测Res对大鼠心脏组织病理学变化的影响每组取3只大鼠心脏组织，制作石蜡切片（厚度5 μm），脱蜡后苏木精染色10 min，用自来水洗涤直至不再有红色液体流下，用1%的盐酸酒精溶液分化1 min，自来水洗涤1 min，再用伊红染色3 min左右，自来水洗涤1 min，将组织切片逐级脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察Res对大鼠心脏组织病理学变化的影响。

1.2.6 TUNEL检测Res对大鼠心脏组织中心肌细胞凋亡的影响每组取3只大鼠心脏组织，制作石蜡切片（厚度5 μm），60℃烤片3 h，脱蜡后进行抗原修复，然后将玻片浸入0.1 M TBS溶液放置30 min，用PBS溶液冲洗后，然后滴加50 μl TUNEL反应液，置于湿盒中37℃孵育1 h，用PBS溶液冲洗后，滴加3%的双氧水10 min，用PBS溶液冲洗后，滴加50 μl Converter-POD，置于湿盒中37℃孵育1 h，DBA显色后用苏木素复染，将组织切片逐级脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下计算出细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.7 Res对大鼠心脏组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表达水平的影响每组取4只大鼠心脏组织，加入细胞裂解液提取总蛋白，用bradford法蛋白定量试剂盒操作说明进行蛋白质含量测定，上样量体积含50 μg蛋白，随后进行SDSPAGE5%积层胶和12%分离胶电泳2.5 h（浓缩胶80 V进入分离胶后调至120 V）。电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，并置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温下摇床封闭2 h后滴加p-Akt、p-JNK3、caspase-3一抗，置于4℃下过夜，复温后滴加二抗，置于37℃条件下放置1 h。显影后采集图片，以GAPDH为内参，采用Gel-Pro analyzer4 软件分析心脏组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3的表达水平。

1.3 统计学分析利用统计学软件SPSS 20.0进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（x ±s）表示，多组采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AMI大鼠模型鉴定与假手术组相比较，模型组大鼠心电图ST段明显抬高，提示AMI模型构建成功（图1）。

图1 假手术组和模型组大鼠心电图情况

表1 Res对大鼠血清中SOD、CK-MB、CK、MDA、TnI活性的影响（x ±s，n=10）

2.2 Res对大鼠血清中SOD、CK、CK-MB、TnI、MDA活性的影响与假手术组相比，模型组大鼠血清中SOD的活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，法舒地尔组和Res组大鼠血清中SOD的活性显著高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；法舒地尔组和Res组大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性显著低于模型组（P＜0.05），差异均有统计学意义。与法舒地尔组相比，Res低、中剂量组大鼠血清中SOD的活性显著低于法舒地尔组（P＜0.05），差异均有统计学意义；Res低、中剂量组大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性显著高于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Res高剂量组大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、SOD、MDA的活性与法舒地尔组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.3 Res对大鼠血清中炎症因子的影响与假手术组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组和Res组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量显著低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与法舒地尔组相比，Res低、中剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量显著高于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05），Res高剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量与法舒地尔组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.4 TTC染色检测心肌梗死面积与假手术组相比，模型组大鼠表现出明显心肌梗死；与模型组相比，法舒地尔组和Res组大鼠心肌梗死面积显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与法舒地尔组相比，Res低、中剂量组大鼠心肌梗死面积显著高于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05），Res高剂量组大鼠心肌梗死面积与法舒地尔组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2，表3）。

2.5 HE染色检测Res对大鼠心脏组织病理学变化的影响HE染色结果显示假手术组心肌细胞结构分明，心肌细胞排列整齐，细胞形态未见明显异常；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，且细胞着色不均，心肌纤维肿胀、断裂；与模型组相比，法舒地尔组和Res组心肌细胞和肌纤维排列相对整齐，且随Res剂量增加，心肌细胞内水肿和炎性细胞浸润情况明显减轻（图3）。

表2 Res对大鼠血清中炎症因子含量的影响（x ±s，n=10）

图2 TTC染色检测心肌梗死面积

表3 各组大鼠心肌梗死面积比较（x ±s，n=3）

图3 HE染色检测大鼠心脏组织病理学变化（×400）

图4 TUNEL检测Res对大鼠心脏组织中心肌细胞凋亡的影响（×400）

表4 TUNEL检测Res对大鼠心脏组织中心肌细胞凋亡的影响（x±s，n=3）

2.6 TUNEL检测Res对大鼠心脏组织中心肌细胞凋亡指数的影响与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞凋亡指数显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组和Res组大鼠心肌细胞凋亡指数显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与法舒地尔组相比，Res低、中剂量组大鼠心肌细胞凋亡指数显著高于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05），Res高剂量组大鼠心肌细胞凋亡指数与法舒地尔组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（图4、表4）。

2.7 Western blot检测Res对大鼠心脏组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表达水平的影响与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织中p-Akt表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠心肌组织中p-JNK3、caspase-3表达水平显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，法舒地尔组和Res组大鼠心肌组织中p-Akt表达水平显著高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；法舒地尔组和Res组大鼠心肌组织中p-JNK3、caspase-3表达水平显著低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与法舒地尔组相比，Res低、中剂量组大鼠心肌组织中p-Akt表达水平显著低于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Res低、中剂量组大鼠心肌组织中p-JNK3、caspase-3表达水平显著高于法舒地尔组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Res高剂量组大鼠心肌组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表达水平与法舒地尔组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）（图5、表5）。

图5 Western blot检测心脏组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3蛋白表达情况

表5 Res对大鼠心脏组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表达水平的影响（x ±s，n=6）

3 讨论

AMI是冠状动脉闭塞后，由于心肌缺血和持续性缺氧造成的心肌细胞代谢障碍及结构损伤，它是临床常见的疾病之一[9,10]。本研究采用结扎冠状动脉前降支的方法构建AMI模型，结果表明，模型组大鼠心电图ST段明显抬高，假手术组心电图未见明显异常，提示AMI模型构建成功。

AMI的发生发展与氧化应激反应和炎症损伤密切相关。研究表明，血清中SOD、CK-MB的活性以及血清中炎症因子IL-6和TNF-α 的含量在AMI的发生、发展中发挥着重要作用[11]，因此缓解AMI的关键环节是抑制氧化应激和炎症反应[12]。AMI中医属于“真心痛”、“胸痹”的范畴，因此，中医治疗AMI以益气养血，正虚补阳为主[13]。Res是从葡萄以及葡萄制品中提取的植物抗毒素，具有治疗心血管、抗肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎等多种药理功能，能够对抗机体的炎症反应、并抑制炎症损伤[4]。有研究表明，法舒地尔通过下调AMI大鼠心肌组织中炎症因子的表达，进而抑制心肌细胞凋亡，并抑制心肌梗死[14]。因此本研究以法舒地尔为阳性药物，探究Res对AMI大鼠心肌的保护作用。

IL-1β、IL-6和TNF-α是组织炎症反应的标志物，参与机体的炎症反应，在病理状态下加重组织细胞损伤。CK在人体组织中广泛存在，在维持细胞内三磷酸腺苷浓度中起重要作用，CK-MB是CK同工酶之一，主要存在于人体心肌中，另外肌钙蛋白是心肌损伤指标中敏感性及特异性最高的标志物。本研究结果表明，与模型组相比，法舒地尔组和Res组心肌细胞和肌纤维排列相对整齐，且炎性细胞浸润情况减轻；法舒地尔组和Res组SOD的活性显著高于模型组（P＜0.05），血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性及IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量显著低于模型组（P＜0.05）；法舒地尔组和Res组心肌梗死面积和细胞凋亡指数显著低于模型组（P＜0.05）；Res高剂量组血清中CK、CKMB、TnI、MDA的活性，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，以及心肌梗死面积和细胞凋亡指数，与法舒地尔组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。HE染色结果显示假手术组心肌细胞结构分明，心肌细胞排列整齐，细胞形态未见明显异常；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，且细胞着色不均，心肌纤维肿胀、断裂；与模型组相比，法舒地尔组和Res组心肌细胞和肌纤维排列相对整齐，且随Res剂量增加，心肌细胞内水肿和炎性细胞浸润情况明显减轻。提示，Res能够抑制AMI大鼠氧化反应、炎症损伤以及心肌细胞凋亡，进而发挥对AMI大鼠的心肌保护作用。

Res对AMI大鼠心肌具有保护作用，但具体的作用机制尚未完全明确。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）、c-Jun氨基末端激酶（JNK3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是细胞凋亡通路中的关键蛋白[15,16]。有研究表明，Akt/JNK3/caspase-3是重要的线粒体凋亡途径，调控Akt/JNK3/caspase-3信号通路对脑缺血/再灌注损伤大鼠具有保护作用[17,18]。然而，Res对AMI大鼠Akt/JNK3/caspase-3信号通路的影响尚未见报道。本研究表明，法舒地尔组和Res组心脏组织中p-Akt表达水平显著高于模型组（P＜0.05），p-JNK3、caspase-3表达水平显著低于模型组（P＜0.05）；Res高剂量组心肌组织中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表达水平与法舒地尔组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。推测，Res是能够调控AMI大鼠Akt/JNK3/caspase-3信号通路的活性，通过抑制细胞内线粒体凋亡发挥对心肌细胞的保护作用。

综上所述，Res对AMI大鼠心肌具有保护作用，推测这一作用是通过调控Akt/JNK3/caspase-3信号通路抑制心肌细胞凋亡，本研究为AMI的临床治疗提供一定的理论依据。