三叶青叶黄酮类化学成分的UPLC—MS/MS定性分析及HPLC含量测定

邓思珊　刘洪旭　马丽红

[摘要] 目的 定性、定量分析三葉青叶黄酮类化学成分。 方法 采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对三叶青叶化学成分进行鉴定，色谱柱为C18 Luna Omega（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速0.4 mL/min；柱温35℃；进样量5 μL；全扫描模式扫描。采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定三叶青叶中5种碳苷黄酮的含量。色谱柱为Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2% H3PO4（10∶90，V/V）；流速为1 mL/min；检测波长为350 nm；室温；进样量20 μL。 结果 三叶青叶中共鉴定出6个化学成分，其中5个黄酮成分的保留时间、光谱图和质谱碎片离子信息与对照品一致，分别为异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素。HPLC测定8个不同产地来源的样品中上述5种成分含量，各成分线性关系良好（r > 0.9997），加样回收率在95.0%～105.0%之间。 结论 三叶青叶子中主要含2类碳苷黄酮，即荭草素类和牡荆素类；本研究建立的方法可定性、定量分析分析三叶青叶中主要化学成分，可用于控制药材质量。

[关键词] 三叶青；黄酮类；超高效液相色谱-串联质谱；高效液相色谱

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0080-06

[Abstract] Objective Qualitative and quantitative analysis of the chemical constituents of flavonoids in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum. Methods The chemical constituents in leaves of Tetrastigma hemsleyanum were identified by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The column was C18 Luna Omega （2.1 mm × 100 mm， 1.6 μm）； the mobile phase was acetonitrile-water （50∶50， V/V）； the flow rate was 0.4 mL/min； the column temperature was 35°C； the injection volume was 5 μL； full scan mode. The contents of five carbon glycosides in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum were determined at the same time by high performance liquid chromatography （HPLC）. The column was Ultimate XB C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； the mobile phase was acetonitrile - 0.2% H3PO4 （10∶90， V/V）； the flow rate was 1 mL/min； the detection wavelength was 350 nm； room temperature； injection volume was 20 μL. Results A total of 6 chemical components were identified in the leaves， and the retention time， spectrum and mass spectrometry information of the 5 flavonoids were consistent with the control， which were isohumullin， valerin， vitexin and rhamnoside， vitexin， isovite. The contents of the above five components in the samples from 8 different origin sources were determined by HPLC. The linear relationship of each component was good （r > 0.9997）， and the recovery rate was between 95.0% and 105.0%. Conclusion The leaves of Tetrastigma hemsleyanum are mainly composed of two kinds of carbon flavonoids， valerin and vitexin. The method established in this study can qualitatively and quantitatively analyze the main chemical components in the leaves of Tetrastigma hemsleyanum and control the quality of the medicinal materials.

[Key words] Tetrastigma hemsleyanum； Flavonoids； Ultra performance liquid chromatography-tandem mass； High performance liquid chromatography

三叶青来源于葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diel et Gilg）的干燥全草，是福建、浙江地区传统习用青草药[1]。全草均可入药，一直以来以地下块根的药用效果最好，用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎等症。现代药理研究表明，三叶青具有、镇痛及解热、抗肿瘤、、抗病毒、免疫调节、保肝护肝等作用[2-11]。近年来三叶青藤叶也广泛应用于临床，疗效显著，并且价格及产量均高于生长年限需要4年的地下块根，故研究其地上部分具有重要意义。三叶青全草化学成分有黄酮类、黄烷醇类、三萜类、甾醇类和有机酸等化合物[12-14]，黄酮类是其主要成分。液质联用、高效液相色谱（HPLC）均可用于化学成分的定性、定量分析，具有高效、快速、操作简单等优点[15-21]。深入分析三叶青叶中黄酮类成分，以期为其进一步研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HP1100型液相色谱仪，配二极管阵列检测器（DAD）（美国HP公司）；超高效液相色谱仪（UHPLC-30A，日本岛津公司）；线性离子阱四极杆质谱仪，电喷雾离子源（4000 Q-Trap，美国 Applied Biosystems公司）。

1.2 试药

异荭草素（CAS：4261-42-1，HPLC≥98%）、荭草素（CAS：28608-75-5，HPLC>98%）、异牡荆素（CAS：29702-25-8，HPLC≥98%）、牡荆素（CAS：3681-93-4，HPLC≥98%）、牡荆素鼠李糖苷（CAS：64820-99-1，HPLC>98%）均购于北京中科质检生物技术有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

实验用三叶青藤叶由福州集珍园生物科技有限公司提供，经福建省医学科学研究院药物所林文津副研究员鉴定均为葡萄科植物三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diel et Gilg）的地上部分，取干葉粉碎后作为样品。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

混合对照品母液 分别取异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素对照品0.0080、0.0070、0.0090、0.0090、0.0100 g，置50 mL量瓶中，加60%甲醇溶解，定容，即得。

混合对照品溶液 取2 mL混合对照品母液，置10 mL容量瓶中，60%甲醇稀释至刻度，即得。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 HPLC分析用供试品溶液 取三叶青叶粉末1 g，精密称定，加60%甲醇50 mL，超声处理30 min，冷却，60%甲醇补足减失的重量，摇匀，上清液用0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.2.2 UPLC-MS/MS分析用供试品溶液 取“2.2.1”项下的供试品溶液，用水稀释100倍，即得。

2.3 超高效液相色谱及质谱条件

超高效液相色谱条件 色谱柱：Phenomenex公司C18 Luna Omega（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱温：35℃；进样量：5 μL。

质谱条件 全扫描模式；分辨率2000；扫描范围m/z 100～800；气帘气压力（CUR）：25.0 psi（氮气）；电喷雾电压（IS）：4500 V；离子源温度（TEM）：450℃；雾化气压力：55 psi；辅助气压力：55 psi。

2.4 供试品成分鉴定

通过电喷雾质谱在线监测，负离子模式下采用全扫描模式进行扫描，确认其分子离子峰，总离子流图见图1，以流动注射的方式对相应的离子进行子离子扫描，通过不同的碰撞能量，提供其质谱碎片信息，推测出三叶青中有大量碳苷黄酮牡荆素和荭草素类结构，且可能存在同分异构体。结果见表1。

2.5 检测波长与光谱分析

在210～400 nm范围对三叶青叶供试品溶液色谱峰进行光谱分析，发现两类黄酮的光谱特征为：峰1、2、3均显示255 nm肩峰、270 nm主峰和350 nm主峰；峰4、5、6、7均显示270 nm主峰和340 nm主峰。见图2。实验选择350 nm为检测波长。

2.6 HPLC色谱条件

色谱柱：Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2% H3PO4（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：350 nm；室温；进样量：20 μL。上述条件下，5种成分分离良好。对照品与供试品HPLC分离结果见图3。

2.7 HPLC方法学考察

2.7.1 线性关系 分别取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10mL容量瓶中，60%甲醇稀释至刻度，混匀，精密量取20 μL，注入色谱仪，按照“2.6”项条件进行测定。以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

2.7.2 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次，记录异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素各峰面积。其RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验 精密称取三叶青叶粉末（产地为福州闽侯）1 g，共6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定。异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素的RSD分别为2.30%、3.52%、3.15%、2.86%、2.33%，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性 取同一份供试品溶液（产地为福州闽侯），分别于配制后的0、2、8、12、24、36 h依法测定，记录峰5种成分的峰面积。异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素的RSD分别为1.81%、3.80%、4.73%、4.17%、3.14%，表明处理后的供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.7.5 加样回收率 取6份同一批已知含量的三叶青叶粉末（福州闽侯）0.5 g，精密称定，精密加入“2.1”项下的混合对照品母液1～3 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表3。异荭草素、荭草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素的平均回收率分别为103.0%、103.9%、97.5%、101.0%、97.4%，RSD分别为1.28%、1.67%、1.73%、2.75%、2.79%。表明该方法准确度良好。

2.9.6 样品含量测定 将8份三叶青叶按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定。各产地样品色谱图见图4，结果见表4。结果表明不同产地叶子中各碳苷黄酮含量与组成都有很大差别，其中广西天峨样品中5个成分均未检出，但未知强峰通过DAD光谱分析具有同牡荆素类黄酮相同的光谱特征。

3 讨论

文献报道三叶青中含有各类黄酮[22-23]，测定总黄酮的报道较多[24-26]。笔者取三叶青根粉、藤与叶采用HPLC测定11种黄酮（白藜芦醇、槲皮素、山萘酚、白皮杉醇、香橙素、芦丁、虎杖苷、异槲皮苷、根皮苷、芸香糖苷、紫云英苷），只检出叶中有极少量的异槲皮素和芦丁；通过HPLC法的光谱扫描发现三叶青叶提取物中有2组相似的未知黄酮类成分；通过UPLC-MS/MS分析鉴定及HPLC对照实验证实这些信号极强的黄酮为异荭草素鼠李糖苷、异荭草素、荭草素，牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素，同时含有绿原酸。笔者认为对于未知活性成分，特别是有特征光谱吸收峰的黄酮化合物，可采用HPLC结合二极管阵列检测器对主峰定性，再通过高分辨率的液质质技术分析鉴定主峰结构。

质谱分析证实[M-H]- m/z 577.1是牡荆素鼠李糖苷/异牡荆素鼠李糖苷，已知峰4为牡荆素鼠李糖苷，根据出峰顺序推断，峰5可能为异牡荆素鼠李糖苷。异荭草素/荭草素[M-H]-m/z 447.2与异牡荆素/牡荆素[M-H]-m/z 431.3相差16（1个O原子），[M-H]- m/z 593.3的组分较[M-H]-m/z 577.1牡荆素鼠李糖苷/异牡荆素鼠李糖苷多出16（1个O原子），根据其HPLC出峰顺序位于异荭草素之前，推断峰1可能是极性较大的异荭草素鼠李糖苷或荭草素鼠李糖苷。

文献报道碳苷黄酮有较强的药理活性[27-28]，文中仅记录5个成分，其他成分仍有待进一步研究证实。笔者认为可采用一测多评法计算总黄酮含量。

此外，三叶青根粉采用HPLC和UPLC-MS/MS均未检测到碳苷黄酮成分，藤部位黄酮含量亦较低，黄酮主要集中在叶子部位。

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（收稿日期：2018-04-09 本文编辑：王 蕾）