元胡止痛滴丸对痛经模型大鼠的镇痛作用及机制研究

冯玥　张宗鹏　申秀萍

[摘要] 目的 觀察元胡止痛滴丸对痛经模型大鼠的镇痛作用，并探讨其可能的作用机制。 方法 选取雌性SPF级Wistar大鼠60只，按照体重随机区组的方法将其分为对照组，模型组，元胡止痛滴丸小（0.2 g生药/kg）、低（0.4 g生药/kg）、中（0.8 g生药/kg）、高（1.6 g生药/kg）剂量组，每组各10只。腹腔注射缩宫素致痛诱发大鼠形成痛经模型，腹腔注射苯甲酸雌二醇致敏后连续灌胃给药3 d，观察元胡止痛滴丸对痛经引起的扭体反应的潜伏期和扭体次数的影响，并检测血浆中前列腺素F2α、前列腺素E2等与疼痛相关因子的水平。 结果 与模型组比较，元胡止痛滴丸低、中、高剂量组大鼠的扭体次数明显减少（P < 0.05或P < 0.01），扭体潜伏期有延长趋势，但由于个体差异导致标准差较大，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，元胡止痛滴丸中、高剂量组大鼠血浆中β内啡肽及前列腺素E2含量显著升高（P < 0.05或P < 0.01），去甲肾上腺素、5羟色胺及前列腺素F2α/前列腺素E2比值显著降低（P < 0.05或P < 0.01），元胡止痛滴丸高剂量组大鼠前列腺素F2α含量明显降低（P < 0.05）；元胡止痛滴丸中、高剂量组大鼠血浆中血栓素B2、6-酮前列腺素F1α含量与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 元胡止痛滴丸在0.8～1.6 g生药/kg剂量下对痛经模型大鼠具有显著的镇痛作用，改善外周血中与疼痛相关的前列腺素、单胺类递质及β-内啡肽水平是其发挥多途径镇痛作用的可能机制。

[关键词] 元胡止痛滴丸；镇痛；痛经；缩宫素

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0008-05

The study of analgesic effect and mechanism of Yuanhu Zhitong Dropping Pills on dysmenorrhea model rats

FENG Yue1，2 ZHANG Zongpeng1，2 SHEN Xiuping1，2 HU Jinfang1，2

1.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research New Drug Evaluation Co.， Ltd.， Tianjin 300301， China； 2.Tianjin Engineering Research Center of Drug Preclinical Assessment Technology， Tianjin 300301， China

[Abstrac] Objective To study the analgesic effect of Yuanhu Zhitong Dropping Pills on dysmenorrhea model rats and to discuss the possible mechanism. Methods Sixty female SPF grade Wistar rats were divided into control group， model group， small-dose （0.2 g crude drug/kg）， low-dose （0.4 g crude drug/kg）， medium-dose（0.8 g crude drug/kg）， high-dose（1.6 g crude drug/kg） of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group according to weight random block method， with 10 rats in each group. The model of dysmenorrhea was induced by intraperitoneal injection of oxytocin， and Yuanhu Zhitong Dropping Pills was administered by intragastric administration for 3 days after sensitized by intraperitoneal injection of estradiol benzoate. The effect of Yuanhu Zhitong Dropping Pills was observed by detecting latency stage and times of writhing response induced by dysmenorrhea， and the level of factors related to pain such as prostaglandin F2α and prostaglandin E2 in plasma were also detected. Results Compared with model group， the times of writhing response in low-dose ， medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the preclinical period of writhing response in low-dose， medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group showed an extension trend， while the standard deviation was large due to individual differences， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Compared with model group， the level of β-endorphin and prostaglandin E2 in medium-dose and high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， and the level of noradrenaline， 5-hydroxytryptamine， the ratio of prostaglandin F2α to prosta-glandin E2 decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， the level of prostaglandin F2α in high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group decreased significantly （P < 0.05）. There was no statistically significant difference on the level of thromboxane B2 and 6-Keto-prostaglandin F1α between medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group and model group （P > 0.05）. Conclusion Yuanhu Zhitong Dropping Pills has significant analgesic effect on dysmenorrhea model rats with the dose of 0.8-1.6 g crude drug/kg. The multi-way analgesic effect is probably related to improved levels of pain-associated prostaglandins， monoamine transmitters， and β-endorphin in peripheral blood.

[Key words] Yuanhu Zhitong Dropping Pills； Analgesia； Dysmenorrhea； Oxytocin

元胡止痛滴丸为中药复方制剂，由延胡索和白芷组成，具有理气、活血、止痛之效[1]，对胃痛、痛经、胁痛和偏头痛有显著疗效，收录于《中国药典》2015年版一部，现已被列入国家医保甲类药品、国家重要保护品种目录，并被2009版《国家基本药物目录（基层版）》确定为纯中药止痛药物[2]。延胡索有活血、止痛等功效，白芷可散风除湿、通窍止痛、消肿排脓。元胡止痛方中的51种化学成分，来源于延胡索药材的主要为生物碱类成分，来源于白芷药材的主要为以欧前胡素、异欧前胡素为主的香豆素类成分[3]。本研究通过苯甲酸雌二醇致敏、缩宫素致痛来制备大鼠痛经模型，探讨元胡止痛滴丸对痛经模型大鼠的镇痛作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取雌性SPF级Wistar大鼠60只，体重180～200 g，2～3月龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物使用合格证号：SCXK（京）2012-0001，动物质量合格证编号：11400700057537。动物饲养于屏障环境，温度范围20～26℃，湿度范围40%～70%，全新风换气次数不少于15次/h，12 h/12 h明暗交替，SPF级大鼠维持饲料喂养，自由进食和饮水。

1.2 药物与试剂

元胡止痛滴丸（天津药物研究院中药现代研究部，棕褐色粉末，浓度2 g生药/g，批号：20131209，临用前加去离子水溶解）；苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂，批号：131006）；缩宫素注射液（安徽宏业药业有限公司，批号：140539）；戊巴比妥钠（德国Merck，批号：120505）；5-羟色胺（5-HT）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、去甲肾上腺素（NA）、β-内啡肽（β-EP）、前列腺素F2α（PGF2α）、前列腺素E2（PGE2）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）均购于武汉华美生物工程有限公司（批号分别为C2015820175、B18011509、C0119820174、C02011506、C0601620173、B18011508、B19011507）。

1.3 仪器

BT224S型电子天平（Max=220 g，d=0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机（离心半径10 cm，上海安亭科学仪器有限公司）；Varioskan Flash酶标仪（Thermo Scientific）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及痛经模型的制备 采用体重随机区组的方法将大鼠分为对照组，模型组，元胡止痛滴丸小、低、中、高剂量组，剂量分别为0.2、0.4、0.8、1.6 g生药/kg（分别相当于临床等效剂量的1/4、1/2、1、2倍），每组10只，参照文獻方法[4]建立大鼠痛经模型，除对照组外，其余大鼠连续10 d皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，第1、10 天每只0.5 mg/d，余日均每只0.2 mg/d。

1.4.2 给药及扭体反应的考察 于注射的第9天（此时动物情绪较为紧张，乳头膨大，以往研究发现此时子宫变得粗大，对缩宫素变得更为敏感）开始各组按“1.4.1”中剂量灌胃给药，对照组及模型组灌胃给5 mL/kg去离子水，连续给药3 d，末次给药后40 min，每只动物腹腔注射缩宫素注射液2 U，注射后立即记录大鼠因子宫强烈收缩致痛经而产生扭体现象的潜伏期及30 min内的扭体次数，计算疼痛潜伏期延长率及扭体反应抑制率。潜伏期超过30 min的按照30 min计。疼痛潜伏期延长率=（给药组平均扭体潜伏期-模型组平均扭体潜伏期）/模型组平均扭体潜伏期×100%，扭体反应抑制率=（模型组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/模型组×100%。

1.4.3 血浆各指标的检测 缩宫素注射1 h后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，肝素钠抗凝、腹主动脉取血4～5 mL，3000 r/min离心10 min取血浆，-20℃保存备用。按ELISA试剂盒说明书测定血浆中5-HT、NA、β-EP、PGF2α、PGE2、TXB2、6-Keto-PGF1α的含量。

1.5 统计学方法

数据用SPSS 18.0软件进行处理，计算资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组扭体反应比较

与对照组比较，模型组大鼠的扭体潜伏期显著缩短（P < 0.01），扭体次数显著增加（P < 0.01）。与模型组比较，元胡止痛滴丸低、中、高剂量组大鼠的扭体次数明显减少（P < 0.05或P < 0.01），并呈剂量相关性；元胡止痛滴丸低、中、高剂量组大鼠扭体潜伏期有延长趋势，但由于个体差异导致标准差较大，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组血浆中β-EP、5-HT、NA含量比较

与对照组比较，模型组血浆β-EP含量显著降低（P < 0.01），5-HT、NA含量显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，元胡止痛滴丸低、中、高剂量组β-EP含量明显升高（P < 0.05或P < 0.01），元胡止痛滴丸中、高剂量组NA、5-HT含量显著降低（P < 0.01）。见表2。

2.3 各组血浆中前列腺素、血栓素含量比较

与对照组比较，模型组血浆中PGF2α、6-Keto-PGF1α含量以及PGF2α/PGE2比值显著升高（P < 0.01），PGE2含量显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，元胡止痛滴丸高剂量组PGF2α含量明显降低（P < 0.05）；元胡止痛滴丸中、高剂量组PGE2含量明显升高（P < 0.05），PGF2α/PGE2比值明显降低（P < 0.05或P < 0.01），并呈剂量相关性。元胡止痛滴丸各剂量组TXB2及6-Keto-PGF1α含量与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

痛经是妇科最常见的症状之一，是指行经前后或月经期出现下腹疼痛、坠胀，伴腰酸或其他不适[5-6]，分为原发性和继发性两种。其中原发性痛经的发生主要与月经时子宫内膜PG、血浆缩宫素、β-EP含量上升、钙离子的参与及镁离子的不足有着较为密切的关系，造成子宫平滑肌收缩增强，血管痉挛，引起疼痛[7-9]。缩宫素可使离体子宫产生强烈而持续的收缩，引起小动脉持久而强烈的收缩，使子宫肌层组织缺血而导致类似于原发性痛经时子宫的收缩[10]，常被用作痛经模型的工具药物。关于痛经病理模型的制备，首先应用苯甲酸雌二醇或乙烯雌酚致敏，然后应用缩宫素或前列腺素等致痛。缩宫素为制备痛经模型时经常使用的致痛药物，不仅因为其可以直接作用于子宫肌细胞引起子宫收缩，还可同时刺激子宫内膜细胞释放PGF2α引起痛经。PGF2α作用于螺旋小动脉壁上的PGF2α受体，引起子宫平滑肌痉挛性收缩，刺激子宫自主神经疼痛纤维而发生痛经[11]，而PGE2则能抑制子宫平滑肌的自发活动[12-13]。研究表明，痛经患者血中PGF2α含量及PGF2α/PGE2比值升高是造成痛经的直接原因，降低PGF2α水平或PGF2α/PGE2比值可在一定程度上缓解疼痛[14-15]。在黄体期PGE2的含量升高，抑制子宫平滑肌自发性活动，月经期则相反，溶解酶破坏子宫内膜细胞，释放大量PGF2α引起子宫平滑肌收缩，月经期子宫平滑肌对PGF2α的作用最为敏感[16-17]。

血栓素A2（TXA2）有收缩血管和聚集血小板作用，而前列腺环素（PGI2）有扩张血管和抑制血小板聚集的作用。正常生理状态下TXA2/PGI2处于动态平衡状态，血管内环境保持稳定。动态平衡失调时比值升高，导致血管收缩，使血液处于高凝状态，是原发性痛经的诱因之一[18]。由于TXA2、PGI2短时间内水解成稳定的TXB2和6-Keto-PGF1α，所以检测TXB2、6-Keto-PGF1α的含量即可反映TXA2、PGI2的水平[19-21]。β-EP是一种神经内分泌激素，具有内源性镇痛作用，子宫是其靶器官之一。黄体期β-EP水平降低可使子宫功能活动失常，成为疼痛的原因之一[22-24]。单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要物质，与致痛和镇痛都有着密切的关系。在外周，5-HT主要由血小板摄取和释放，是一类重要的致痛因子，NA在外周也有致痛的作用[25]。

元胡止痛滴丸作为中药大品种，有网络药理学研究表明，它可能通过作用于激素调节、中枢镇痛、解痉、炎症等通路起到了治疗原发性痛经的作用，为止痛的分子作用机制和主要活性成分提供了参考范围[26-27]。研究发现，钙离子作为公认的细胞第二信使，其浓度变化是调节子宫平滑肌细胞收缩的关键因素。Ca2+通过外钙内流或内钙释放引起子宫平滑肌细胞内Ca2+超载，引起能量耗竭、细胞膜受损，并直接作用于子宫平滑肌引起强烈收缩[28-29]，后续试验将着重考察对Ca2+的影响。从本研究结果中不难看出，大鼠经苯甲酸雌二醇致敏后，腹腔注射缩宫素致痛可使子宫产生痉挛性收缩而形成痛经模型，较对照组扭体反应潜伏期明显缩短，扭体次数显著增加，0.8～1.6 g生药/kg剂量的元胡止痛滴丸可显著减少痛经模型大鼠的扭体次数，延长疼痛潜伏期，具有显著的镇痛作用，这与其调节外周血中与疼痛相关的PGF2α、PGE2、β-内啡肽、5-HT及NA水平密切相关，是其发挥镇痛作用的可能机制，其镇痛作用具有多途径的特点，具体作用靶点及环节需进一步研究。

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（收稿日期：2018-04-02 本文编辑：罗乔荔）