活血降糖饮对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的防治作用及对scrib蛋白表达的影响

刘德亮　李惠林　渠昕

[摘要] 目的 研究活血降糖飲对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的防治作用及对scrib蛋白表达的影响。 方法 通过高脂高热卡饮食和小剂量链脲佐菌素尾静脉注射诱导建立2型糖尿病模型大鼠，应用SPSS软件将模型大鼠随机分为模型组、中药组、双胍组，另设正常组，每组各10只。药物干预后检测血脂、血糖及胰岛素，并应用原位末端标记法检测胰岛β细胞凋亡情况；分离纯化胰岛细胞后，通过免疫印迹方法检测各组大鼠胰岛细胞scrib蛋白表达。 结果 与模型组比较，中药组和双胍组大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹胰岛素、餐后2 h胰岛素、胰岛素抵抗指数和总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而高密度脂蛋白胆固醇无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，中药组和双胍组大鼠胰岛β细胞凋亡指数亦明显降低（P < 0.01），胰岛细胞scrib蛋白表达明显上调（P < 0.01）。 结论 活血降糖饮干预治疗具有调脂降糖、改善胰岛素抵抗的作用，并可有效防治β细胞凋亡，其作用机制可能与上调胰岛细胞scrib蛋白表达有关。

[关键词] 活血降糖饮；2型糖尿病；细胞凋亡；Scrib；Hippo通路

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0004-05

The preventive effect of Huoxue Jiangtang Decoction on pancreatic β cell apoptosis and its influence on scrib protein expression in type 2 diabetes rats

LIU Deliang1 LI Huilin1 QU Xin1 ZHAO Hengxia1 CHU Shufang1 LIU Xuemei1 ZENG Lin2 ZHANG Xuewen2

1.Department of Endocrinology， Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518033， China； 2.the Fourth Clinical Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Shenzhen 518033， China； 3.Institute of Traditional Chinese Medicine Master， Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712046， China

[Abstract] Objective To investigate the preventive effect of Huoxue Jiangtang Decoction on pancreatic β cell apoptosis and its influence on scrib protein expression in type 2 diabetes mellitus rats. Methods The type 2 diabetes mellitus model was induced by high fat and high calorie diet and intravenous injection of low dose of Streptozotocin. By SPSS software， all model rats were divided into model group， herbal group， Metformin group， besides， normal group was added， 10 rats in each group. After treatment， the blood glucose， insulin and lipids were tested； the pancreatic β cell apoptosis was examined by terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling method； and scrib protein expression was detected by Western blot in extracted and purified pancreatic islet cells. Results Compared with model group， the levels of fasting blood-glucose， 2 h postprandial blood glucose， fasting insulin， 2 h postprandial insulin， insulin resistance index and total cholesterol， triacylglycerol， low density lipoprotein cholesterin in herbal group and Metformin group were all decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）， while high density lipoprotein cholesterol had no obvious changes， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with model group， the β cell apoptosis indices in herbal group and Metformin group were also decreased （P < 0.01）， meanwhile， the scrib protein expression in islet cells was increased significantly （P < 0.01）. Conclusion Huoxue Jiangtang Decoction treatment has the effects of regulating blood lipid， decreasing blood glucose， improving insulin resistance， which can effectively prevent β cell apoptosis. The mechanism may be related to the upregulation of scrib protein expression in islet cells.

[Key words] Huoxue Jiangtang Decoction； Type 2 diabetes mellitus； Cell apoptosis； Scrib； Hippo pathway

生活水平提高和饮食结构改变导致我国2型糖尿病（T2DM）发病率逐年增加[1-2]。在T2DM的进展过程中，β细胞凋亡是重要的病理生理过程之一[3-4]。导致β细胞凋亡的原因众多，近期研究发现，scrib蛋白可通过Hippo信号通路发挥抗凋亡作用[5-6]，笔者前期研究发现，T2DM大鼠胰腺scrib蛋白表达下调，可能是导致β细胞凋亡的原因之一[7]。目前针对β细胞凋亡的防治手段非常有限，因此，有必要开发具有β细胞保护作用的药物。活血降糖饮是深圳市中医院内分泌科协定处方，具有益气养阴、活血通络的作用，笔者前期研究提示其具有良好的降糖调脂作用[7]。本研究建立T2DM大鼠模型，进一步探讨活血降糖饮对β细胞凋亡的防治作用和对scrib蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物购自广州中医药大学实验动物中心，50只（合格证号：44002100006561），约2月龄，体重180 g左右，雄性SD大鼠（SPF级）。饲养环境：温度18～22℃，湿度40%～70%，自由摄食、饮水，自然昼夜节律光照。常规对照饲料（热量构成：脂肪13%，蛋白质23%，碳水化合物64%）及高脂饲料（热量构成：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）均购于广东省医学实验动物中心。

1.2 实验药物

活血降糖饮制剂的准备按本课题组前期研究中所采用的方法准备[7]，二甲双胍为中美上海施贵宝出品（商品名：格华止，AAP0010），用蒸馏水溶解，调整浓度至20 mg/mL，4℃储存。

1.3 试剂与仪器

血糖、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（F006、F002、A110-1、A113-1、A112-1）；胰岛素放免试剂盒购于北京原子能科学研究所（YB-10069）；链脲佐菌素（STZ）、Histopaque、Cy3标记的抗兔IgG购自Sigma公司（S0130、10771、C2821）；小牛血清购于美国GIBICO公司（10100147）；胶原酶P、TUNEL试剂盒购于罗氏公司（Roche）（11213865001、11684795910）；兔抗大鼠胰岛素、scrib、β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司（sc-28737、sc-10731）；蛋白抽提试剂盒及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德公司（AR0101、BA1054）。

主要检测仪器采用DYCZ-24型垂直板电泳槽（北京六一仪器厂）和LSM700激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司）。

1.4 方法

1.4.1 实验动物模型和分组 经过1周的适应性喂养后，随机选出10只大鼠作为正常组，标准饲料喂养，自由进食进水。以高脂高热卡饮食喂养其余大鼠，4周后，模型组大鼠按30 mg/kg剂量尾静脉注射用柠檬酸缓冲液配制的2% STZ溶液，1周后，各组大鼠均行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），检测空腹血糖（FPG）及餐后2 h血糖（2 h PBG），通过正常组大鼠计算FPG、2 h PBG 95%可信区间，FPG、2 h PBG均高于正常范围上限20%认为T2DM模型成功，应用SPSS软件将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、中药组、双胍组，加上正常组共四组，每组各10只。

1.4.2 动物处理 正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃，中药组灌服活血降糖饮煎剂，剂量为5 g/（kg·d）（按生药质量换算），双胍组以200 mg/（kg·d）剂量治疗。治疗期间正常组喂以常规饲料，其他组均继续喂以高脂高热卡饲料。各组均治疗8周后，行OGTT，检测FPG、2 h PBG、空腹胰岛素（FINS）、餐后2 h胰岛素（2 h INS），1周后，禁食24 h，腹腔注射麻醉（戊巴比妥钠45 mg/kg）后，腹主动脉取血，分离血清检测血脂，各组随机选取3只大鼠取胰腺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片；另外7只大鼠通过原位灌注法分离胰岛细胞，用于检测scrib蛋白表达。

1.5 观察指标

①按照试剂盒说明书检测各血清学指标。②TUNEL法检测胰岛β细胞凋亡：严格按照试剂盒说明书操作。③胰岛细胞分离和纯化：按参考文献[8]的方法分离胰岛，大鼠取血后，经胆总管注射0.75 mg/mL胶原酶P（4℃预冷）10 mL（pH 7.6～7.8，Ca2+ 7.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L），迅速摘取膨胀的胰腺，置于Hank液中，38℃消化10 min，加入4℃ Hank液（含10%小牛血清）终止消化，过600 μm钢筛后，Hank液重悬，4℃，1000 r/min离心2 min（r = 144 mm）洗涤×2次后，4℃，3000 r/min，20 min（r = 144 mm），Histopaque梯度离心纯化胰岛，取中间界面的胰岛细胞，4℃ Hank液1000 r/min离心2 min（r = 144 mm）洗涤2次备用。④Western blot检测胰岛细胞scrib蛋白表达：分离纯化的胰岛细胞按按照蛋白抽提试剂盒说明书操作提取总蛋白，考马斯亮蓝G-250测定蛋白浓度；10% SDS-PAGE凝胶电泳（各样品上样量均为50 μg），湿转法转膜后，封闭2 h，4℃孵育过夜（抗体工作浓度为1∶1000），第2天TBST洗膜后用二抗孵育2 h（二抗工作浓度为1∶5000）后，进行杂交ECL化学发光。分析每条带的吸光度值，用蛋白/内參（β-actin）的比值表示各蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

统计学分析采用SPSS 22.0软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间差异采用单因素方差分析（one way ANOVA），组间多重比较，使用Bonferroni检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较

与正常组比较，模型组FPG、2 h PBG、FINS、2 h INS、HOMA-IR均明显升高，差異有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，中药组、双胍组FPG、2 h PBG、FINS、2 h INS、HOMA-IR均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠血脂水平比较

与正常组比较，模型组TC、TG、LDL-C均明显升高，HDL-C明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，中药组、双胍组TC、TG、LDL-C均明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而HDL-C无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠β细胞凋亡情况比较

激光共聚焦显微镜下观察，红色荧光为胰岛β细胞，绿色荧光为凋亡细胞，红色荧光和绿色荧光重叠为凋亡的β细胞。每张切片随机选取4个视野，计数每个视野胰岛中标记的阳性凋亡细胞数及胰岛细胞总数。根据凋亡细胞数占胰岛总细胞核数百分比计算凋亡指数（AI），取平均值。正常组β细胞凋亡较少（图1A～C，封三）；模型组β细胞凋亡细胞明显增多（图1D～F，封三）；中药组、双胍组β细胞凋亡较模型组明显减少（图1G～L，封三）。由图1M（封三）所见，模型组β细胞凋亡指数明显高于正常组（P < 0.01），而各治疗组胰岛β细胞凋亡指数明显低于模型组（P < 0.05）。

2.4 各组大鼠胰岛β细胞scrib蛋白表达情况

图2为提取纯化的β细胞。与正常组比较，模型组scrib蛋白表达明显下降（P < 0.01），而与模型组比较，中药组和双胍组scrib蛋白表达均明显上调，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

3 讨论

细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，中医理论对死亡的认识大多认为“阴阳离决，精气乃绝”，从维持阴阳平衡以维持生命活动和阴阳相互关系来看，“阴者，藏精气而其亟也”，说明阴精是人体生命活动的物质基础，《黄帝内经》中亦有云：“奉阴者寿，任阳者夭。”细胞是人体的组成部分，细胞的生死与人的生老病死息息相关，如β细胞的大量死亡则会导致糖尿病的发生，结合经典的“三消”理论，应用中医理论辨治糖尿病应以益气养阴为大法。

活血降糖饮是本课题组所在国家重点专科协定处方，由黄芪、生地、丹参等中药组成，具有益气养阴、活血化瘀的功效。本课题组前期研究表明[9-10]，T2DM患者除血糖外，其血TC、TG较正常对照组显著升高，经用活血降糖方治疗后，FPG、TC均显著降低。本研究再次提示，活血降糖饮对T2DM动物模型具有良好的降糖调脂、改善胰岛素抵抗的作用，同时，可以改善β细胞凋亡。

细胞凋亡的诱发因素、发生机制和涉及到的信号途径众多，如氧化应激与炎症途径[11]、内质网应激[12]、Caspase家族、B细胞淋巴瘤蛋白家族途径[13]等。而Hippo通路是近年发现的一条进化上保守的信号级联通路，它可以通过调节细胞增殖、凋亡、分化和干/祖细胞命运来控制器官大小[14]，此通路活化后抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[15-16]。Yes相关蛋白（YAP）作为该信号通路重要的核心转录共激活因子，可通过不同通路促进细胞凋亡[17-18]。scrib属于肿瘤的肿瘤抑制基因[19]，近来，scrib被证明参与Hippo信号转导通路[20-21]，研究表明，scrib能与Fat1相互作用抑制YAP在核内定位及激活，从而抑制细胞凋亡[22-23]。

本研究发现，模型组大鼠胰岛细胞scrib蛋白表达下调，而经活血降糖饮治疗后，胰岛细胞scrib蛋白表达上调，这可能是活血降糖饮抑制胰岛细胞凋亡的作用机制之一。在以后的研究中，将进一步研究活血降糖饮对Hippo信号通路中其他重要信号分子的调控作用，以进一步阐明活血降糖饮降糖调脂的作用机制。

[参考文献]

[1] Wang Z，Adair LS，Cai J，et al. Diet Quality Is Linked to Insulin Resistance among Adults in China [J]. J Nutr，2017， 147（11）：2102-2108.

[2] Luo B，Zhang J，Hu Z，et al. Diabetes-related behaviours among elderly people with pre-diabetes in rural communities of Hunan，China：a cross-sectional study [J]. BMJ Open，2018，8（1）：e15747.

[3] Chen C，Wu S，Lin X，et al. ERK5 plays an essential role in gestational beta-cell proliferation [J]. Cell Prolif，2017， 51（3）：e12410.

[4] Dlamini Z，Mokoena F，Hull R. Abnormalities in alternative splicing in diabetes：therapeutic targets [J]. J Mol Endocrinol，2017，59（2）：R93-R107.

[5] Pearson HB，Mcglinn E，Phesse TJ，et al. The polarity protein Scrib mediates epidermal development and exerts a tumor suppressive function during skin carcinogenesis [J]. Mol Cancer，2015，14：169.

[6] Perez E，Lindblad JL，Bergmann A. Tumor-promoting function of apoptotic caspases by an amplification loop involving ROS，macrophages and JNK in Drosophila [J]. Elife，2017，6：e26747.

[7] 劉德亮.血瘀和脂毒与糖脂代谢紊乱的关系及活血降糖饮的治疗作用[D].广州：广州中医药大学，2015.

[8] Gotoh M，Maki T，Satomi S，et al. Reproducible high yield of rat islets by stationary in vitro digestion following pancreatic ductal or portal venous collagenase injection [J]. Transplantation，1987，43（5）：725-730.

[9] 李惠林，张志玲，李顺民，等.活血降糖方对Ⅱ型糖尿病人红细胞膜脂区流动性的影响[J].陕西中医学院学报，2000，23（4）：44-45.

[10] 张志玲，李惠林，董彦敏，等.活血降糖饮对2型糖尿病代谢及血液流变学的疗效观察[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（7）：70-71.

[11] Bajaj M，Suraamornkul S，Kashyap S，et al. Sustained reduction in plasma free fatty acid concentration improves insulin action without altering plasma adipocytokine levels in subjects with strong family history of type 2 diabetes [J]. J Clin Endocrinol Metab，2004，89（9）：4649-4655.

[12] Litwak SA，Wali JA，Pappas EG，et al. Lipotoxic Stress Induces Pancreatic beta-Cell Apoptosis through Modulation of Bcl-2 Proteins by the Ubiquitin-Proteasome System [J]. J Diabetes Res，2015，2015：280615.

[13] Lupi R，Dotta F，Marselli L，et al. Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets：evidence that beta-cell death is caspase mediated，partially dependent on ceramide pathway，and Bcl-2 regulated [J]. Diabetes，2002，51（5）：1437-1442.

[14] Huang J，Wu S，Barrera J，et al. The Hippo signaling pathway coordinately regulates cell proliferation and apoptosis by inactivating Yorkie，the Drosophila Homolog of YAP [J]. Cell，2005，122（3）：421-434.

[15] Yeung B，Khanal P，Mehta V，et al. Identification of Cdk1-LATS-Pin1 as a novel signaling axis in anti-tubulin drug response of cancer cells [J]. Mol Cancer Res，2018， 16（6）：1035-1045.

[16] Gao Y，Yi J，Zhang K，et al. Downregulation of MiR-31 stimulates expression of LATS2 via the hippo pathway and promotes epithelial-mesenchymal transition in eso-phageal squamous cell carcinoma [J]. J Exp Clin Cancer Res，2017，36（1）：161.

[17] Li H，He F，Zhao X，et al. YAP Inhibits the Apoptosis and Migration of Human Rectal Cancer Cells via Suppression of JNK-Drp1-Mitochondrial Fission-HtrA2/Omi Pathways [J]. Cell Physiol Biochem，2017，44（5）：2073-2089.

[18] Andrade D，Mehta M，Griffith J，et al. YAP1 inhibition radiosensitizes triple negative breast cancer cells by targeting the DNA damage response and cell survival pathways [J]. Oncotarget，2017，8（58）：98495-98508.

[19] Humbert P，Russell S，Richardson H. Dlg，Scribble and Lgl in cell polarity，cell proliferation and cancer [J]. Bioessays，2003，25（6）：542-553.

[20] 劉红媛，马南希，马瑞，等.Roux-en-Y胃旁路术对2型糖尿病大鼠肝及外周胰岛素敏感性的影响[J].中国实验动物学报，2017，25（3）：270-274.

[21] Doggett K，Grusche FA，Richardson HE，et al. Loss of the Drosophila cell polarity regulator Scribbled promotes epithelial tissue overgrowth and cooperation with oncogenic Ras-Raf through impaired Hippo pathway signaling [J]. BMC Dev Biol，2011，11：57.

[22] 上官若男，朱斌，尚画雨，等.改善Ⅱ型糖尿病大鼠糖代谢运动模型的建立[J].中国实验动物学报，2017，25（3）：275-280.

[23] Skouloudaki K，Puetz M，Simons M，et al. Scribble participates in Hippo signaling and is required for normal zebrafish pronephros development [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（21）：8579-8584.

（收稿日期：2018-03-16 本文编辑：张瑜杰）