环境雌激素对新生仔鼠睾丸引带中Notch信号通路的影响

王广欢　陈凯洪　钟军

[摘要] 目的 探討己烯雌酚（DES）对孕期仔鼠睾丸引带组织中Notch信号通路的影响。 方法 将45只8～10周龄健康雌性SD大鼠采用随机数字表法分为对照组、实验1组、实验2组，每组15只。实验1、2组分别给予DES 0.1、25.0 μg/（kg·d），按常规雌雄比例2∶1合笼。每组均以仔鼠出生当天记为生后0 d（PD0），分别于生后1 d（PD1）和生后7 d（PD7）时取雄鼠睾丸引带，采用RT-PCR和Western blot测定Notch1、Hes1、表皮生长因子受体（EGFR）和转化生长因子-α（TGF-α）的表达。 结果 在PD1和PD7时，实验1组中Notch1、Hes1、EGFR和 TGF-α mRNA表达水平均较对照组和实验2组增高（P < 0.05），而实验2组中只有TGF-α mRNA表达水平较对照组增高（P < 0.05）。在PD1时，实验1组中Notch1、Hes1、TGF-α蛋白表达水平较对照组增高，实验2组中Notch1、EGFR、Hes1蛋白表达水平较对照组增高（P < 0.05）；在PD7时，实验1组中Hes1、EGFR蛋白表达水平较对照组增高，实验2组中Notch1、Hes1、EGFR蛋白表达水平较对照组增高（P < 0.05）。与实验1组比较，实验2组PD1时EGFR蛋白表达水平增高，PD7时Notch1、Hes1、TGF-α蛋白表达水平增高（P < 0.05）。 结论 环境雌激素可影响仔鼠睾丸引带Notch信号通路的表达，可能是外源性雌激素影响睾丸引带发育和增殖的机制之一。

[关键词] Notch信号通路；环境雌激素；睾丸引带；表皮生长因子受体

[中图分类号] R977.12 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0017-05

Effects of environmental estrogen on Notch signaling pathway in neonatal rat′s gubernaculum

WANG Guanghuan1 CHEN Kaihong1 ZHONG Jun1 WANG Fusheng1 XU Chengbin1 JIANG Xuewu2

1.Department of Pediatric Surgery， the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College， Guangdong Province， Shantou 515041， China； 2.Department of Pediatric Surgery， Women and Children Hospital of Shenzhen University， Guangdong Province， Shenzhen 518118， China

[Abstract] Objective To explore the effect of diethylstilbestrol （DES） on Notch signaling pathway of chorda gubernaculum in offspring rats. Methods Forty-five healthy female SD rats aged 8-10 weeks were divided into the control group， experimental group 1 and 2 according to the random number table， with 15 rats in each group. The experimental group 1 and 2 were given DES 0.1 μg/（kg·d） and DES 25 μg/（kg·d） respectively. According to the conventional ratio of male to female 2∶1 cage. The day of offspring birth of each group was recorded as day 0 after birth （PD0）. The chorda gubernaculum was taken at PD1 and PD7 respectively. The expressions of Notch1， Hes1， EGFR and TGF-α were analyzed by RT-PCR and Western blot imprinting. Results At PD1 and PD7， the mRNA expression of Notch1， Hes1， EGFR and TGF-α in the experimental group 1 were higher than those in the control group and the experimental group 2 （P < 0.05）， while only TGF-α mRNA in the experimental group 2 was higher than that in the control group （P < 0.05）. At PD1， the levels of Notch1， Hes1 and TGF-α protein in the experimental group 1 were higher than those in the control group， and the levels of Hes1 and EGFR at PD7 were increased （P < 0.05）. Compared with control group， only the levels of Notch1， EGFR and Hes1 protein were in the experimental group 2 increased at PD1， and the levels of Notch1， Hes1 and EGFR protein were increased at PD7 （P < 0.05）. Compared with the experimental group 1， only EGFR protein increased in the experimental group 2 at PD1， while Notch1， Hes1 and TGF-α protein increased at PD7 （P < 0.05）. Conclusion Environmental estrogen can affect the expression of Notch signaling in gubernaculum of offspring rats， which may be one of the mechanisms of exogenous estrogen affecting the development and proliferation of gubernaculum.

[Key words] Notch signaling pathway； Environmental estrogen； Gubernaculum； Epidermal growth factor receptor

环境雌激素可通过影响睾丸引带的增殖，进而影响生殖系统发育，但具体机制至今尚不清楚[1]。既往相关研究多集中在引带组织成分和细胞形态[2-3]，而对于细胞发育相关的调控机制研究较少[4]。Notch信号通路已被证实在多种细胞生长发育中起关键作用，其改变将引起细胞增殖异常[5-6]。基于出生前后睾丸引带细胞表现出活跃的增殖和分化状态，本研究通过采用己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）作用于孕鼠，观察仔鼠睾丸引带中Notch信号通路关键信号分子Notch1和Hes1以及调控因子表皮生长因子受体（EGFR）和转化生长因子-α（TGF-α）mRNA和蛋白质的表达，初步探讨Notch信号在DES影响的仔鼠睾丸引带中的表达及意义。

1 对象与方法

1.1 实验动物

8～10周龄健康雌性SD大鼠45只，体重30～35 g，购自汕头大学医学院实验动物中心[合格证号：SYXY（粤）2017-0079]。

1.2 实验分组

SD大鼠45只，采用随机数字表法将其分为对照组、实验组1、实验组2，每组15只。实验组1、2分别给予DES 0.1、25.0 μg/（kg·d）。DES以二甲基亚砜（DMSO）和生理盐水为溶剂；对照组仅给予DMSO和生理盐水。

1.3 实验方法

大鼠购回饲养1周后，于下午6：00，按常规雌雄比例合笼，合笼后每隔8 h（每日8：00、16：00、24：00）检查雌鼠有无出现阴栓，以发现阴栓作为受孕标志。发现阴栓当天定为妊娠第0天，记为GD0。在GD9～GD17上午8：00皮下注射给药，其中对照组给予DMS 16.5 μL/（kg·d），生理盐水33.0 mL/（kg·d），实验组分别给予0.1、25.0 μg/（kg·d）DES。每组所用的DES均溶于DMSO与生理盐水中，剂量同对照组。以仔鼠出生当天记为生后0 d，记为PD0，分别于PD1、PD7时取材，每组15只。

1.4 RT-PCR法检测仔鼠睾丸引带组织中Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α mRNA表达水平

总RNA的提取，将液氮中保存的仔鼠睾丸引带组织按组织总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，经紫外线分光光度计测定A260/A280比值，取A260/A280比值在1.8～2.1的RNA用于后续试验。引物均在北京Invitrogen公司合成（表1）。以提取的总RNA为模板，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，以其为模板，进行PCR反应。反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加RNase Free ddH2O至25 μL。反应条件：94℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃ 40 s，72℃ 5 min，共30个循环；72℃ 5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用Quantity One软件进行图像分析，测定灰度值，以目的条带/β-actin基因的灰度比值表示Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α mRNA相对转录水平。

1.5 Western blot法检测仔睾丸引带组织中Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α蛋白表达水平

采用Quality One 分析软件进行蛋白相对表达量的定量分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 PD1、PD7时各组仔鼠睾丸引带Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α mRNA相对转录水平

PD1、PD7时，实验1组中Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α mRNA转录水平均较对照组和实验2组增高（P < 0.05），而实验2组中只有TGF-α较对照组增高（P < 0.05）。其余基因mRNA相对转录水平组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 PD1、PD7时各组仔鼠睾丸引带Notch1、Hes1、EGFR和TGF-α蛋白表达水平

PD1时，实验1组中Notch1、Hes1和TGF-α蛋白表达水平均较对照组增高（P < 0.05），实验2组中只有Notch1、Hes1、EGFR蛋白表达水平较对照组增高（P < 0.05）。而实验2组中只有EGFR蛋白表达水平较实验1组明显增高（P < 0.05）。其余基因蛋白表达水平组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表3、图1。PD7时，实验1组中Hes1和EGFR蛋白表达水平均较对照组增高（P < 0.05），实验2组中Notch1、Hes1和EGFR蛋白表达水平较对照组增高（P < 0.05）。实验2组中只有Notch1、Hes1和TGF-α蛋白表达水平较实验1组增高（P < 0.05）。其余基因蛋白表达水平组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表3、图2。

3讨论

睾丸引带是胚胎期与睾丸等泌尿生殖系统器官发育密切关联的重要睾丸外结构[7]。睾丸引带结构复杂且在胚胎期变化大，且外源性雌激素可引起睾丸引带结构紊乱，抑制其增殖[8-10]，但机制尚不清楚。基于前期对于胚胎期睾丸引带组织表现出活跃增殖的认识[11]，目前已发现，Notch信号通路在多种细胞分化与增殖中起到关键作用。本研究发现，Notch信号通路在DES作用后的大鼠睾丸引带组织中表达异常，且在出生后1 d和7 d的仔鼠睾丸引带中表达不一致。推测DES可能通过影响Notch信号通路，进一步影响了睾丸引导的发育和增殖。在环境雌激素对影响生殖系统发育的研究方面，既往实验多基于传统的药理学实验毒性试验，采用高剂量来观察其影响效应[12]，事实上，环境雌激素更多的是针对日常生产生活中的污染状况，即与环境密切相關的相对低剂量暴露[13]，本研究采用了高、低两个剂量组，进行对比研究。

本研究主要观察了Notch信号通路关键因子Notch1和Hes1，发现在生后1 d，低剂量DES的实验1组中Notch1和Hes1 mRNA和蛋白表达均高，而高剂量DES实验2组中，Notch1和Hes1 mRNA表达差别不明显，但蛋白表达增高。提示不同剂量的DES对睾丸引带中Notch信号通路关键因子的影响有差别，推测DES可通过增强Notch信号通路进一步影响睾丸引带的发育，且与DES作用的剂量关系较大。在生后7 d，实验1组中Notch1、Hes1 mRNA和Hes1蛋白增高，而实验2组中，Notch1和Hes1蛋白增高。提示在生后7 d时DES对睾丸引带中Notch信号通路仍有影响，且与生后第1天比较有不同。推测随着日龄的增长，DES仍通过影响Notch信号通路影响对睾丸引带的发育，但影响力较生后第1天弱。

同时本研究还发现，在生后第1天和7天时低剂量DES与高剂量中Notch1和Hes1mRNA对比表明无论在生后第1天和7天低剂量DES对睾丸引带中Notch信号通路基因水平的影响均较高剂量组大，推测睾丸引带中Notch信号通路对于低剂量DES的影响更为敏感。

Notch信号还会其他信号分子或者信号通路的调控[14-15]。有报道EGFR信号系统对Notch信号通路起到拮抗的作用[16]。EGFR已被证实在睾丸有表达，参与了雄性生殖系统的生长发育和生殖功能的维持[17-18]。本研究亦显示，EGFR信号通路相关分子EGFR和TGF-α在睾丸引带有表达，且在DES作用后的睾丸引带组织中表达也发生了改变，发现不同剂量的DES对Notch信号通路的抑制信号系统EGFR也有影响且存在差别，推测DES可通过同时增强EGFR信号系统进一步影响睾丸引带的发育，且与DES作用的剂量各不相同。在生后第1天和7天低剂量DES与高剂量睾丸引带中EGFR信号系统中EGFR和TGF-α mRNA和蛋白的表达对比变化，也从侧面帮助推测睾丸引带中Notch信号通路对于低剂量DES的影响更为敏感。

另外，在DES作用后Notchl、Hes1、EGFR和TGF-α mRNA和蛋白的表達没有一致的趋势，我们推测，在这个偶联的过程中可能有许多影响因素，如mRNA的降解、修饰折叠等[19-20]，因此mRNA升高时，蛋白不一定会升高。

综上，本研究发现环境雌激素对新生仔鼠睾丸引带中Notch信号通路有明显影响，为更全面地研究外源性雌激素影响生殖系统发育的可能途径提供证据。

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