基于图像处理技术快速检测茯砖茶中“金花菌”数量

吕嘉枥，孟雁南，史朝烨，罗潇

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021）

茯砖茶属于黑茶类，是一种后发酵茶，其特殊加工工艺在于“发花”过程，通过控制环境达到特定的温湿度条件来促使自然益生菌体-“金花菌”的生长[1]，使得茶叶表面具有大量肉眼可见的金黄色颗粒，即“金花菌”的子囊果。因为“金花菌”的存在使得茯砖茶内部成分发生转化，具有比其他黑茶更好的风味及功能特性，因此“金花菌”的数量是判断茯砖茶质量优劣的重要指标之一[2～4]。“金花菌”是散囊菌目发菌科散囊菌属的一种多型真菌，常见的是其有性繁殖方式，在某些条件下会出现无性繁殖特征[5]。目前对茯砖茶中“金花菌”的测定主要采用GB4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中的方法[6]，并无专门的检测方法。国标法现已有许多争议，首先国标法检测的不是真正意义上的“金花菌”，由于茶叶在处理过程中子囊破裂程度不一，其子囊果，子囊，子囊孢子均可以形成一个菌落，检测差异较大，且无性繁殖特征的出现对检测结果影响更大，此外国标法测定的时间较长，不利于快速评价茯砖茶的质量，因此急需一种适用于茯砖茶中“金花菌”数量的检测方法。

如果可以找到一种能够直接辨别茯砖茶中“金花菌”颗粒并计数的方法，且将其快速统计出来，则可以达到准确检测茯砖茶中“金花菌”数量并评价茯砖茶品质的目的。本方法基于茯砖茶中“金花菌”颗粒较大，直径在100 μm～175 μm之间[7,8]，颜色金黄色，与茯砖茶基质及其他杂菌的颜色差异较大，且肉眼可以直接观察的原理，结合Image Pro Plus软件中的图像处理功能和自动计数功能，设计出了一种准确快速统计茯砖茶中“金花菌”数量的方法，为“金花菌”的数量检测及茯砖茶的品质评价提供理论技术依据。

1 材料与方法

1.1 茯砖茶样品

茯砖茶样品主要采集自陕西省泾阳县不同产区，参照 GB/T 8302[9]取样方法采集成品包装茯砖茶，采集的样品均符合 GB/T 9833.3-2013[10]及 DBS 61/0006-2014[11]中对茯砖茶的感官要求，样本信息如表1 所示。

表1 茯砖茶样品Table 1 The sample of Fuzhuan brick tea

1.2 仪器与设备

高分辨率摄像机；Image Pro Plus图像处理软件。

1.3 实验方法

1.3.1 茯砖茶切割及切割面成像

采用茶叶切割装置按需要将茯砖茶进行任意面切割，之后采用高分辨率拍照设备对茶切割面进行拍照成像，获取茶切割面图像，并得到茶切割面的面积S。

1.3.2 图像处理

采用Image Pro Plus对茯砖茶切割面进行图像处理，总共分4个步骤。

（1）根据茯砖茶横切面的大小对图片进行 n等分，使得每个等分区域的“金花菌”颗粒数在 0～200个，对n个等分区域同时进行以下处理；

（2）处理Color Model，通过Color Channel，调节Color Model为HSI模式，设置Generate channel为Hue；

（3）进行Filter处理，首先进行Morphological/Filters/Open处理，使“金花菌”颗粒之间分离隔痕突出明显，然后进行Edge/Filters/Variance处理，使“金花菌”颗粒边缘突出明显，最后进行 Enhancement/Filter/Sharpen处理，使“金花菌”颗粒边缘锐化；

（4）进行 Contrast Enhancement处理，先进行Hilite & Shadow处理，增强“金花菌”颗粒Hilite度，降低茶砖背景的Shadow值，接着进行调节伽马值，对比度和亮度，使图片区分度更高。

1.3.3 “金花菌”数量检测

采用Image Pro Plus软件中Measure/Count/Size对处理后的图像中“金花菌”进行自动计数。方法有两种，方法一为Intensity Range Selection选择Automatic Dark Objects的设置计出灰度在0～128的对象，点击Count进行自动计数。点Delete可以恢复到计数前。方法二为Intensity range Selection选择Manual，进行Select Colors，在Segmentation进行Color Cube Based选择，用吸管工具选取图片色彩“金花菌”的色彩范围，相近色彩即自动被选中，然后点击Count进行自动计数。在Segmentation进行Histogram Base选择，将RGB改为HSI（H为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度，I为强度），使用H，从H中选择“金花菌”的色彩范围，同理S，I，微调选择线使选中区域将所有“金花菌”都包括在其中。点击Count进行自动计数；

当图片上有大量测量对象时，很难完全正确地选择上所有测量区域，会有少量“金花菌”漏选或错选，可将计数后的“金花菌”进行分析，自动确定“金花菌”颗粒的平均面积，确定范围进行再次计数，记录此次数值，将计入此次数量的非目标物剔除，对图片进行3次计数，直至把所有“金花菌”全部选中。最后统计结果，运用下列公式进行计算。

1.3.4 结果验证

采用人工直接计数法对“金花菌”计数结果进行验证。将拍摄得到的茯砖茶切面图在进行图像处理之前，肉眼直接统计图片不同区域内的“金花菌”颗粒数。验证结果用相对误差表示，相对误差=|人工计数-自动计数|/自动计数×100%。

2 结果与分析

2.1 茯砖茶切割及切割面成像

对茯砖茶进行任意面切割后采用高分辨率拍照设备对茶切割面进行拍照成像，获取茶切割面图像。切割效果如图1所示。茶叶经切割后，茶砖一分为二，切割面平整，茯砖茶内部“金花菌”颗粒饱满，颜色金黄，清晰可见，可直接用于后续的“金花菌”计数。

图1 茯砖茶切割面Fig.1 Cutting surface of Fuzhuan brick tea

2.2 图片预处理

将含有“金花菌”的茯砖茶表面成像到系统内，将其平均等分为n个区域，如图2所示，接下来对n个等分区域中的两个区域（图3）为案例，运用Image Pro Plus软件系统进行以下分步处理展示，并准确自动的记录出茯砖茶表面“金花菌”数量。

图2 茯砖茶n等分效果图Fig.2 Dividing effect diagram of brick tea

图3 茶砖切割面局部放大效果图Fig.3 Partial enlargement of the cutting surface

2.3 颜色处理

由于摄像机电源本身的干扰噪声、光照不均匀等问题都会影响到图片采集的效果，使得“金花菌”颗粒不明显（图1），所以需要对图片的颜色进行处理，可通过Color Channel，调节Color Model为HSI模式，设置Generate channel为Hue。处理结果如图4所示，可看出经过Color Model处理的“金花菌”，色泽与茶基质差异更为明显突出，但图片中还有少量菌丝及其他非目标杂质，需要对其进行后续处理。

图4 经Color Model处理的“金花菌”Fig.4 “Golden Flower” fungus treated by color model

2.4 Filter处理

Filter工具可以提取图形中的有用图形信息，从而排除干扰测量的图形信息。采用Filter主要对图片进行了形态学、增强和边缘三种处理。有一些“金花菌”颗粒由于各种原因连接在了一起，这样在统计的时候软件会把它们当作一个完整颗粒，对结果造成误差，所以，首先进行形态学处理，采用 Morphological/Filters/Open功能键，使“金花菌”颗粒之间分离隔痕突出明显，处理效果如图5所示，可以看出经过形态学处理的“金花菌”边缘变得平滑，原来图片中白色的菌丝杂质也被去掉，“金花菌”颗粒之间的连接被分开。但“金花菌”颗粒边缘并不明显，所以需要进行边缘处理，即采用Edge/Filters/Variance功能键以强效“金花菌”边缘，处理效果如图6所示，可以发现“金花菌”颗粒边缘突出明显。但边缘颜色过暗，与背景颜色区分度不高，所以需要对图片进行增强处理，可采用Enhancement/Filter/Sharpen功能键，使“金花菌”颗粒边缘锐化，处理效果如图7所示，可以看出图片中“金花菌”颗粒为黄色圆形，边缘平整光滑，可与图片背景及其他图形杂质区分。

图5 经形态学处理的“金花菌”Fig.5 “Golden Flower” fungus treated by morphological

图6 经边缘处理的“金花菌”Fig.6 “Golden Flower” Fungus treated by Edge

图7 经增强处理的“金花菌”Fig.7 “Golden Flower” Fungus treated by Enhancement

2.5 Contrast Enhancement处理

经滤镜处理的“金花菌”虽与图片背景区分，但图片中“金花菌”亮度和对比度不一致，后期根据颜色计数时可能会存在误差所以需要进行 Contrast Enhancement处理，先进行Hilite & Shadow处理，增强“金花菌”颗粒Hilite度，降低茶砖背景的Shadow值，接着进行调节伽马值，对比度和亮度，处理效果如图8所示，可以看出此处理可以突出测量对象，使金花菌与茶背景区分更加明显，且“金花菌”具有独特的形态学特征，可根据此种特征直接进行计数操作。

图8 经Contrast Enhancement处理的“金花菌”Fig.8 “Golden Flower” fungus treated by Contrast Enhancement

2.6 自动计数

采用吸管工具点击目标区域，就可选中该点的颜色，选取完AIO后就可以对选中的object进行自动计数操作。如图9所示，图中的绿色数字即为自动计数结果，区域1统计了73个“金花菌”颗粒，区域2统计了191个“金花菌”颗粒，可以看到还有少量未被系统识别的目标，所以有必要在第一次测量后核对测量结果。

图9 第一次自动计数结果Fig.9 First automatic counting result

对于未选中的区域，可以手工添加一个测量对象，在未选中的地方多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。将计数后的“金花菌”进行分析后，自动确定“金花菌”颗粒的平均面积，确定测量范围进行再次计数，记录此次数值，由图10可看出，重复2次选择目标区域后，系统将图9未统计出的“金花菌”颗粒进行了计数，图10中数字前标识P的即为新增加的“金花菌”颗粒数，由图可看出区域1新增加了66个“金花菌”数量，区域2新增加了29个，每个区域的“金花菌”数量即为多次测量结果之和。

图10 重复自动计数结果Fig.10 Repeated automatic counting results

最后将上述计数结果保存至测量环境文件夹中，此文件夹记录了所有的参数设置，直接调用测量环境文件夹中的参数实现图像批量化、快速处理，极大地提高了样品的测量速度。保存步骤如下[12]：打开一张待分析的图片，点击菜单栏上的“Macro”-“Record Macro”按钮，在弹出的“Record Macro”对话框中给文件夹输入一个名字，如“金花菌数量测量”，在“Shortcut Key”中为该文件夹设置一个快捷键，如“Ctrl+A”（图11）。将图像处理、分析的过程录制成一个宏文件后，直接使用“Ctrl+A”快捷键对茯砖茶的其他图像进行“金花菌”计数。

图11 通过录制‘宏’文件实现图像批处理Fig.11 Image batch processing by recording a “macro” file

2.7 结果统计与验证

为了验证此方法对图片中“金花菌”计数的可行性，采用上述方法对其他区域中的“金花菌”子囊果进行计数，以人工直接计数法结果为对照，每个区域分别计数三次，计算两种方法的相对误差，统计结果如表2所示。

表2 “金花菌”数量的计数结果Table 2 Counting results of the number of “Golden Flower” Fungus

从表2可以看出，自动计数结果与人工直接计数结果相比较，最大相对误差为 2.59%，最小相对误差为0.50%，平均相对误差为1.43%，使用本方法对茯砖茶切面图的每个区域检测结果比人工直接计数法相对误差较小，结果较为接近。且自动计数结果普遍略低于人工计数的结果，但标准偏差却小于人工计数方法，这说明自动计数法在很大程度上避免了主观误差。

为了进一步验证自动计数法在成品茯砖茶中计数的可行性，采用上述方法对每个茯砖茶切面中的金花菌进行计数，以人工直接计数法测得的金花菌数量为参考，每一样品计数三次，利用EXCEL求得每一样品在不同计数方法下的“金花菌”数量平均值及标准偏差，利用SPSS软件对不同样品的两种检测结果进行配对t检验，结果如表3所示。

用SPSS对每个样品在两种检测方法下的结果进行配对样品t检验，由表3可以看出，图像处理计数法对茯砖茶中“金花菌”的测定结果误差较小，同一样品三组平行测量值较为接近，且不同样品采用图像处理计数法和人工直接计数法测得的结果标准偏差差别不大，t值在-4.274～0.113之间，基本为负值，说明图像处理方法的检测结果略低于人工测量结果，这可能是由于人工直接计数法是利用人工数茯砖茶表面的“金花菌”颗粒数，不可避免地对“金花菌”进行主观选择，所以计数结果略高。自由度为 2，显著性 P值均大于0.05，说明图像处理计数法与人工直接检测结果之间的差异不显著。以上分析说明图像处理法的结果客观性更强、准确性较好，计数方法及结果可靠，可以用于茯砖茶中“金花菌”数量的检测，且用软件进行检测能够提高茯砖茶中“金花菌”数量检测的速度及准确性，从而达到快速准确的评价茯砖茶质量的目的，具有很高的实用性。

表3 茯砖茶“金花菌”计数比对表Table 3 The comparison table of the “Golden Flower” Fungus of Fuzhuan tea

3 结论

3.1 茯砖茶中“金花菌”的数量是判断茯砖茶品质的重要指标之一。“金花菌”是一种既可产生子囊果也可产生分生孢子的多型真菌，子囊果圆形，内部包裹着无数具拟薄壁组织的子囊，子囊内含 8个子囊孢子[13,14]，其有性世代和无性世代在不同培养条件下表达数量不一[15～17]。而茯砖茶表面的金花即是“金花菌”有性世代的子囊果结构[18]。对茯砖茶中“金花菌”的检测方法都是按照GB 4789.15-2016食品安全国家标准-食品微生物学检验中的霉菌和酵母计数的方法执行的。但因该方法中样品在前处理时“金花菌”破裂程度不一，其子囊果、子囊、子囊孢子均可形成单个菌落，使得“金花菌”的检测重复率较低，计数结果也不是真正意义上的“金花菌”数量[19]，且茯砖茶中的有性子囊果在培养过程中会转化为无性世代的分生孢子结构[20]，呈烟灰色至灰绿色，与其他霉菌较难区别；其次由于茯砖茶发酵属于较复杂的微生物发酵[21,22]，大量其他微生物的存在会抑制“金花菌”的生长，从而影响“金花菌”的检测结果；第三，由于霉菌生长周期较长，该检测方法需要一周左右，耗时长。第四，同一个样品取样点不一样时，其检测结果差异也较大。要解决国标方法中存在的问题，可以采用加大样品平行量的方法，但工作量较大，不现实；要么优化“金花菌”数量的检测方法，而目前对“金花菌”检测方法优化的研究少之又少，且均是基于国标方法，虽使检测误差降低1个数量级，但耗时仍然很长[23,24]。

3.2 本方法基于茯砖茶中的“金花菌”颗粒在 100µm～175 µm之间，颜色为金黄色，与其它杂菌和茶基质差异较大，在显微镜下清晰可辨的原理，利用人工直接计数的准确性作为依据，通过茶的切割，获得茶切割面，然后利用高分辨率拍照设备获取茶切割面图像，再利用本方法软件自动计数方法进行茯砖茶中的“金花菌”的数量统计，结果表明：本检测方法与人工直接计数法无差异，检测结果可靠，快速准确地实现了茯砖茶中“金花菌”数量的检测；通过对茯砖茶切面图像中“金花菌”的数量进行自动计数，能够提高“金花菌”计数的准确性，提高了计数的效率，从而实现准确快速评价茯砖茶质量的目的。本方法测得的结果是茯砖茶表面的“金花菌”形成的子囊果数量，与国标等计数存在差异，虽然经理论推理可行，采用茯砖茶样品进行检测后也与人工直接计数法无差别，但本方法还需对大量的茯砖茶样品进行检测，以完善其操作，并建立相关的检测方法及标准。