宫颈鳞状细胞癌组织中CD44v6、LYVE-1表达与患者临床病理特征及预后的关系

周小庆

(沈阳医学院附属中心医院，沈阳110024)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，发病率居高不下，且近年有年轻化趋势[1]。我国宫颈癌发病率位于世界第二，每年新发病例约13.2万例，约占世界宫颈癌新发病例总数的28%[2]。为减轻宫颈癌对妇女健康的威胁，早期诊断、合理制定临床治疗方案尤为重要。宫颈癌的组织分型多为鳞状细胞癌与腺癌，其中又以鳞状细胞癌发病率最高。白细胞分化抗原44号拼接变异体v6(CD44v6)蛋白是一种表面跨膜黏附分子，在生物体内广泛分布，在细胞与细胞、细胞与基质之间的特异性黏附过程中起重要作用[3]。目前普遍认为，CD44v6基因的表达能够影响肿瘤细胞的转移、浸润能力[4]，因而将其作为一项可能的预测肿瘤患者预后的生物标记物。淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)是一类生物体内高度同源的分子，也能作为肿瘤组织淋巴管的特异标志[5]。本研究利用免疫组化(SP法)检测CD44v6与LYVE-1蛋白在宫颈组织中的表达，旨在探讨宫颈鳞状细胞癌组织中CD44v6与LYVE-1的表达变化及意义，希望能为临床诊疗方案的制定提供新的参考方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2007年10月～2012年3月沈阳医学院附属中心医院宫颈活检、手术取得的宫颈鳞状细胞癌患者肿瘤组织标本78例份，患者年龄31～69(52.21±8.49)岁，其中年龄≤50岁者34例，>50岁者44例；FIGO分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期48例；肿瘤直径：≤4 cm者45例，>4 cm者33例；组织学分化程度：低分化者38例，高、中分化者40例；肌层浸润深度：≤1/2肌层者32例，>1/2肌层者46例；无淋巴管浸润者64例，有淋巴管浸润者14例；无淋巴结转移者59例，有淋巴结转移者19例。宫颈鳞状上皮内病变组织47例份，患者年龄26～71岁、中位年龄56岁，其中低度病变26例、高度病变21例；正常宫颈组织32例份，年龄35～62岁、中位年龄54岁。所有标本经病理科检验确诊后，常规石蜡包埋，储存于-80 ℃冰箱中备用。本研究涉及患者临床资料完整，之前均未接受放疗、化疗等其他抗肿瘤手段治疗。本研究事先经本院医学伦理委员会批准，全程操作符合相关规定。

1.2 宫颈组织CD44v6与LYVE-1蛋白表达的检测 采用免疫组化(SP)法。取保存的宫颈组织石蜡标本4 μm连续切片，常规脱蜡水化，严格按照SP法试剂盒说明书操作。鼠抗人CD44v6单克隆抗体(BioSSTM)、兔抗人LYVE-1多克隆抗体(BioSSTM)、免疫组化(SP)法试剂盒(eBioscienceTM)均购自上海信裕生物科技有限公司。经65 ℃烤片20 min，常规梯度乙醇脱水，PBS冲洗3次，95 ℃水浴修复抗原，PBS冲洗3次，正常血清封闭。用PBS作为阴性组一抗，DAB染色，苏木素复染，常规脱水，干燥后封片。将树胶片置于镜下观察，分别取4个不同视野，每个视野均包含至少200个细胞，取平均值。按如下标准计分：数量占比计分：<5%计0分，5%～25%计1分，>25%～50%计2分，>50%～75%计3分，>75%计4分；染色强度计分：无色计0分，浅着色(浅黄)计1分，着色适中(黄棕色)计2分，深着色(棕褐色)计3分。数量占比与染色强度相乘：<3为阴性，≥3为阳性。

1.3 随访 初步筛选出符合条件的病例之后，剔除之前接受其他抗肿瘤手段治疗的、合并其他种类癌症的、年龄超过75周岁的病例。以患者出院为观察起点，对患者采用电话、电子通讯等手段随访，随访时间截止于2016年10月，随访时长9～73(48.58±16.35)个月，失访6例，随访率92.31%。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。CD44v6、LYVE-1表达的组间比较采用χ2检验、Fisher′s确切概率法，相关性分析采用Spearman秩相关检验。预后分析采用Kaplan-Meier生存曲线法，组间比较采用Log-Rank法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈组织CD44v6、LYVE-1的表达比较 正常宫颈组织、宫颈鳞状上皮内病变组织、宫颈鳞状细胞癌组织CD44v6阳性表达率分别为9.38%(3/32)、44.68%(21/47)、70.51%(55/78)；LYVE-1阳性表达率分别为15.63%(5/32)、55.32%(26/47)、78.21%(61/78)。正常宫颈组织中CD44v6和LYVE-1阳性表达率均低于宫颈鳞状上皮内病变组织(χ2分别为11.220、12.581，P分别为0.001、0.000)及宫颈鳞状细胞癌组织(χ2分别为34.027、37.027，P分别为0.000、0.000)。宫颈鳞状上皮内病变组织CD44v6、LYVE-1阳性表达率低于宫颈鳞状细胞癌组织(χ2分别为8.211、7.260，P分别为0.004、0.007)。

2.2 宫颈鳞状细胞癌组织中CD44v6、LYVE-1的表达与患者临床病理特征的关系 宫颈鳞状细胞癌组织中CD44v6的表达与FIGO分期、组织学分化程度、肌层浸润深度、淋巴管浸润及淋巴结转移相关(P均<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径无关(P均>0.05)；而LYVE-1的表达则与组织学分化程度、肌层浸润深度、淋巴管浸润及淋巴结转移等相关(P均<0.05)，与患者年龄、FIGO分期、肿瘤直径无关(P均>0.05)。见表1。

表1 宫颈鳞状细胞癌组织中CD44v6、LYVE-1表达与患者临床病理特征的关系(例)

2.3 宫颈鳞状细胞癌组织CD44v6与LYVE-1表达之间的关系 Spearman秩相关结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织CD44v6与LYVE-1表达正相关(rs=0.408，P=0.000)。

2.4 CD44v6、LYVE-1在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达与患者预后的关系 至随访截止日，CD44v6阳性患者生存率58.18%(32/55)，生存时间(53.72±3.19)个月；CD44v6阴性患者生存率78.26%(18/23)、生存时间(67.61±2.18)个月；CD44v6阳性患者均低于阴性患者(χ2=4.095，P=0.043；t=19.068，P=0.000)。LYVE-1阳性患者生存率57.37%(35/61)、生存时间(54.44±2.93)个月，LYVE-1阴性患者生存率88.24%(15/17)、生存时间(69.81±2.24)个月，LYVE-1阳性患者均低于阴性患者(χ2=5.698，P=0.017；t=20.036，P=0.000),见图1、图2。

3 讨论

因宫颈癌早期无明显症状，约70%的患者确诊时已属于晚期。目前主要的预防手段为普及防癌知识、重视高危人群、提醒身体异常者及时就医。据国际癌症研究机构估算，若对宫颈癌高发年龄段(35～64周岁)的女性每3～5年进行一次高质量的细胞学筛查，将使参与检查的女性宫颈癌致死率降低至少80%。因此寻找早期诊断的无创、可靠手段能够有效改善宫颈癌患者预后，是当前研究的热点之一。

图1 CD44v6表达阳性与阴性患者的术后生存曲线

图2 LYVE-1表达阳性与阴性患者的术后生存曲线

肿瘤细胞侵袭力、转移力与细胞的黏附力密切相关。细胞黏附力的改变因素之一是细胞黏附因子的异常表达或功能改变。跨膜糖蛋白CD44结构中包含细胞质结构域、跨膜结构域和7个细胞外结构域，参与了细胞-细胞、细胞-基质的相互作用。CD44有许多种变异体亚型，目前根据已经测得的至少10种选择性剪接的外显子以v1～v10区分。其中，CD44v6这一变异体是目前研究的热点。Zhao等[6]通过对187例结直肠癌的患者研究发现，在预测Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者预后方面，CD44v6比CD44更为精确、有效。这可能因为过表达的CD44v6显著地增强了结直肠癌细胞的侵袭和转移能力。许多研究表明，CD44v6表达增强，意味着胃癌、胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤、乳腺癌等肿瘤细胞侵袭力增强。

本研究检测了不同宫颈组织中CD44v6的表达情况，结果表明CD44v6在正常宫颈组织、宫颈鳞状上皮内病变宫颈组织、宫颈鳞状细胞癌宫颈组织中的表达依次递增，表明CD44v6的表达增强，同样能够提高宫颈鳞状细胞的转移能力，此结果与文献报道研究结果近似。本研究还发现，CD44v6的表达与FIGO分期、组织学分化程度、肌层浸润深度、淋巴管浸润及淋巴结转移等临床病理特征相关，表明CD44v6可能参与了宫颈鳞状细胞癌的发生发展。淋巴管转移是宫颈癌癌细胞播散的重要途径之一。近年发现了许多新的主要定位于淋巴管的肿瘤标记物，如LYVE-1、Prox-1、Podoplanin、D2-40等。LYVE-1是Banerji等[7]在寻找CD44相似或相关的透明质酸受体时发现的，与CD44的同源氨基酸序列高达41%，是一种主要表达于淋巴管内皮细胞上的膜蛋白。Bai等[8]利用活体内冷冻技术冷冻了活体小鼠体内的肠系膜淋巴结，发现LYVE-1均匀分布于淋巴管的管腔、基底，但并不在被胶原细胞和平滑肌细胞包围的外层内皮细胞中表达。因此LYVE-1可以被用作特异性淋巴管内皮标志物。Yu等[9]发现，LYVE-1与S1P3共同作用于低相对分子质量透明质酸调控的淋巴管新生，而淋巴管新生是多种肿瘤发生发展的重要步骤。此外，LYVE-1基因被敲除的小鼠体内淋巴管构造和功能均出现明显异常，提示LYVE-1还可能参与调控淋巴管的通透性，从而调控肿瘤的淋巴管侵袭力、淋巴结转移能力。

本研究发现，LYVE-1在正常宫颈组织、宫颈鳞状上皮内病变宫颈组织、宫颈鳞状细胞癌宫颈组织中的表达同样依次递增，且其表达与组织学分化程度、肌层浸润深度、淋巴管浸润及淋巴结转移等临床病理特征相关，与患者年龄、FIGO分期、肿瘤直径无关。这表明LYVE-1表达的上调，意味着宫颈癌细胞侵袭能力和转移能力增强，与文献报道实验结果相符。Spearman秩相关检验的分析结果显示，CD44v6与LYVE-1的表达呈正相关，而两者均与肿瘤的淋巴转移密切相关，由此推测，CD44v6与LYVE-1能够通过相互作用，共同增强宫颈癌细胞的转移能力。经过随访调查，CD44v6与LYVE-1表达阳性的患者生存率、生存时间均较阴性患者低，与之前的免疫组化、相关性检验的结果相印证。进一步提示应当对CD44v6与LYVE-1表达阳性的患者密切监测，个体化治疗，以改善预后。

综上所述，CD44v6、LYVE-1在宫颈鳞状细胞癌组织中过量表达，均与患者不良预后相关，CD44v6、LYVE-1可能参与并促进了宫颈鳞状细胞癌的发生以及恶性进展过程。联合检测CD44v6与LYVE-1将可能为宫颈鳞状细胞癌诊疗方案的制定提供重要参考。