miR-93在食管鳞癌组织和细胞中的表达变化及临床意义

宋卫敏,刘新磊,董玉娟,任传涛

(1潍坊医学院附属益都中心医院，山东青州262500；2德州市人民医院)

食管癌是最常见的高度恶性肿瘤，西方欧美国家以食管腺癌为主，而在中国等亚洲国家以食管鳞癌为主[1]。食管癌往往发现较晚，虽然目前手术及放化疗等治疗手段不断改进，但由于延误诊断和高复发率，食管癌患者的5年生存率仍然较低[2，3]。至今，食管癌的病因及发展机制尚不明确，仍缺少有效的分子标志物和靶向治疗靶点，因此从分子水平阐明食管癌发生、转移的分子机制，寻找特定有效的分子靶向治疗靶点，建立有效的早期诊断、精确评估、判断预后的新方法具有重大意义。微小核糖核酸(miRNA)是一类长度在19～22个核苷酸的内源性、高度保守的单链非编码小RNA，可以通过靶向结合目标mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)，在转录后水平抑制靶基因的表达，从而发挥其生物学功能[4，5]。近年研究证实，miRNA在细胞增殖、凋亡、发展和分化中起着重要调控作用，并与肿瘤的发病、进展及预后关系密切[6，7]。miR-93是近期发现的miRNA家族重要成员之一，属于miR-106b-25 miRNA簇成员。目前研究发现，miR-93在许多恶性肿瘤组织中表达异常，在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用[8]。但目前有关miR-93在食管鳞癌中表达情况的研究甚少。2017年11月～2018年4月，本研究通过qRT-PCR法检测食管鳞癌细胞系和正常食管细胞系、食管鳞癌组织和癌旁组织中miR-93的表达情况，并进一步分析其与患者临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞及组织：人食管鳞癌细胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常细胞系Het-1A均购自中国科学院上海细胞研究所。细胞均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、含5% CO2的培养箱中常规培养。潍坊医学院附属益都中心医院和德州市人民医院手术切除的食管鳞癌组织和对应的癌旁组织(距离肿瘤边缘至少5 cm)新鲜标本110例份，组织标本在离体30 min内生理盐水清洗后置入液氮中，转入-80 ℃冰箱中保存备用。患者术前均未进行放、化疗及生物免疫治疗等任何抗肿瘤治疗，并且未合并其他器官的恶性肿瘤。手术后标本均经病理检查证实为鳞状细胞癌。110例份组织中，患者男78例，女32例；年龄>60岁84例，≤60岁26例；肿瘤直径>5 cm 65例，肿瘤直径≤5 cm 45例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期60例，Ⅲ期50例；肿瘤位置：上段13例，中下段97例；有淋巴结转移71例，无淋巴结转移39例。患者均签署知情同意书，并经医院医学伦理委员会批准。试剂及仪器：TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-93及内参U6引物购自广州锐博生物技术公司；LightCycle 96荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司。

1.2 组织或细胞miR-93表达的检测 采用qRT-PCR法。严格按照TRIzol试剂盒说明书操作提取组织或细胞总RNA，分光光度计检测提取的RNA纯度和浓度，以吸光度(A)值A260nm/A280nm在1.9～2.0范围内的RNA作为合格标准用于后续实验。取总RNA,参照逆转录试剂盒说明书操作逆转录cDNA。以cDNA为模板，利用qRT-PCR试剂盒及特异性引物进行实时荧光定量PCR反应。miR-93引物序列：上游引物：5′-AGTCTCTGGGCTGACTACATCACAG-3′，下游引物：5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40个循环。以U6作为内参照计算miR-93的相对表达量，相对表达量数值采用2-ΔΔCt法计算。

2 结果

2.1 miR-93在食管鳞癌细胞系和食管正常细胞系中的表达 KYSE410、ECA-109、KYSE-510、Het-1A中miR-93的相对表达水平分别为1.01±0.05、5.18±0.23、4.39±0.21、3.36±0.28。与人食管正常细胞系Het-1A相比，人食管鳞癌细胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510中miR-93的表达水平升高(P均<0.01)。见图1。

2.2 miR-93在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达 miR-93在食管鳞癌组织和相对应的癌旁组织中相对表达水平分别为1.03±0.07、7.45±0.45。与癌旁组织相比，食管鳞癌组织中miR-93的表达水平升高(P均<0.01)。见图2。

2.3 miR-93表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系 以miR-93的均值水平为界值，将患者分为miR-93高表达(≥7.45)组58例和miR-93低表达(<7.45)组52例。miR-93的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤位置无关(P均>0.05)。见表1。

图1 miR-93在食管鳞癌细胞系和食管正常细胞系中的表达

注：与Het-1A相比，*P<0.01。

图2 miR-93在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达

表1 miR-93表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系(例)

2.4 miR-93表达与食管鳞癌患者预后的关系 Kaplan-Meier分析结果显示，miR-93高表达患者预后较差(P<0.01)，见图3。Cox多因素回归分析结果显示，淋巴结转移、TNM分期、miR-93表达是影响患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。见表2。

图3 食管鳞癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

表2 食管鳞癌患者预后的Cox回归分析

3 讨论

近年，虽然食管癌的手术及药物治疗取得了一定发展，但食管癌预后仍然较差，食管癌的局部复发及转移是目前制约患者治疗效果，影响其生存期进一步提高的主要瓶颈之一。目前食管癌的发生发展机制尚不完全明确，尚无有效的靶向治疗药物。

研究发现，miRNA在多种癌症中表达异常，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及迁移方面起着重要作用，已成为目前肿瘤研究及基因治疗的热点问题[9]。在食管癌方面，已经证实有许多miRNA参与食管癌的发生、发展、侵袭及转移等[10,11]。miR-93属于miR-106b-25 miRNA簇(miR-106b、miR-93、miR-25)成员之一。既往研究表明，miR-93在众多不同的恶性肿瘤组织中均出现表达水平异常，如在胃癌[12]、肝细胞癌[13]、子宫内膜癌[14]、骨肉瘤[15]中表达增强，而在结肠癌[16]、乳腺癌[17]等中表达受到抑制，但其具体功能尚不清楚。miR-93在不同肿瘤中可能作用于不同的靶基因，从而起着不同的作用。目前，有关miR-93在食管鳞癌中表达情况的研究甚少。本研究通过qRT-PCR检测了110例份食管鳞癌组织和相对应的癌旁组织，人食管鳞癌细胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常细胞系Het-1A中miR-93的表达水平后发现，miR-93在食管鳞状组织和细胞中表达异常增高；并且进一步统计分析发现，miR-93的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，提示miR-93的表达水平异常与食管鳞癌的发生发展及转移密切相关。

目前，有关miR-93与恶性肿瘤患者预后关系的研究较少。已有研究报道，在头颈部鳞癌[18]、胃癌[19]中miR-93的高表达与患者的不良预后相关。本研究中我们通过对食管鳞癌患者进行了术后随访，也发现miR-93高表达组患者预后较差。同时我们进一步通过多变量Cox回归模型分析显示，miR-93高表达是影响患者预后的独立危险因素，提示miR-93可以作为判断食管鳞癌预后的分子生物学标志物。

综上所述，食管鳞癌中miR-93表达异常增高，其异常高表达与肿瘤的发生发展有关，并且是影响患者预后的独立危险因素，本研究为食管鳞癌的靶向治疗以及预后预测提供了新的方向。