负载生长激素脂质体温敏凝胶的制备及体外释放效果

来蕾,崔永新,苏献双,夏应锋,来庆国,李新,林桂梅

(1山东大学第二医院，济南250033;2 锦州医科大学附属第二医院;3山东大学药学院 )

骨缺损修复重建和骨折愈合的研究一直备受口腔颌面外科医生关注，因此，寻找一种简单、方便和安全的促进新骨形成方法一直是很多学者关心和研究的热点。牵张成骨术是通过持续的牵张力延长骨骼的外科手术，此技术最初被应用于矫形外科领域治疗短腿畸形，其后成功引入口腔颌面外科并广泛应用于常规手术难以治疗的各种颅颌面缺损畸形治疗[1]。但牵张成骨也存在着某些局限性如牵张速度受限、治疗周期相对较长、牵张过快过长时会导致新骨形成不良等问题。有很多方法都被尝试用于促进牵张成骨，主要包括细胞因子的局部应用、干细胞治疗、基因治疗和物理疗法等[2]。有研究表明，生长激素(GH)促进成骨功能十分强大，对骨骼的生长发育至关重要。研究证明，通过皮下注射全身应用外源性GH能促进牵张成骨新骨形成和矿化[3，4]，这与以往研究中需要在牵张间隙多点注射相比较，具有使用方便，操作过程简单快捷，剂量可控性强，药剂来源广泛等优点。一直以来，凝胶材料在药剂学领域备受关注，研发者根据临床需要不断地创新，目前临床上常用的植入释药的温敏凝胶有异丙基丙烯酰胺共聚物、嵌段聚合物以及多糖/盐体系三种[5,6]。温敏凝胶属于智能型凝胶的一种，具有对环境温度变化敏感的特点，当处于溶胶状态时可以根据需要随意添加不同性质的药物[7]，以溶液形式给药以后，在周围环境温度升高后即发生溶胶-凝胶的相转变，从而实现了药物缓慢释放且长效的目的。2017年1～12月，本课题组探讨了以磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇，油酸制备GH脂质体，并将制备的脂质体负载到温敏凝胶中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：GH(海济生物技术有限公司),大豆磷脂 (北京奥博星生物技术有限公司),磷酸氢二钠(天津博迪化工股份有限公司),考马斯亮蓝(国药集团化药试剂有限公司),胆固醇(济南岱罡生物技术有限公司),乳酸-乙醇酸(PLGA)-聚乙醇(PEG)-PLGA(济南岱罡生物技术有限公司)。主要仪器：EL204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，N-1001型EYELA旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)，JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜(日本电子公司)，DelsaTM Nano系列Zeta电位和粒径测定仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，透析袋(截留分子量8 000)(北京索莱宝科技有限公司)，UV-2102PCS紫外分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

1.2 GH含量的测定 采用考马斯亮蓝法。精密称量GH 3.2 mg，充分溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)，并稀释为1.6 mg/mL储备液。取PBS 200 μL与马斯亮蓝溶液900 μL考充分混合，涡旋10 s，在400～700 nm波长范围内扫描,以其为空白溶液，取GH溶液200 μL经同样方法处理，在610 nm处有最大吸收。因此确定GH的检测波长为610 nm。标准曲线的建立：精密量取GH储备液，稀释成5、10、20、30、50、70、100 μg/mL系列的标准溶液。以所选溶剂为空白，于选定吸收波长610 nm处测定吸光度值，建立标准曲线，确定线性范围。精密度实验：将低中高(10、30、70 μg/mL)三个浓度梯度的标准溶液放置于室温下，于610 nm波长处测定吸收度。分别于一天内测定5次，求得日内精密度。回收率实验：称取GH适量，加入PBS(pH 7.4)溶解，定容后制成浓度分别为10.0、30.0、70.0 μg/mL的低、中、高三水平溶液，各3份。于610 nm波长处测定吸收度。计算回收率和相对标准偏差。

1.3 负载GH脂质体的制备 精密称取磷脂与GH以6∶1比例溶解于氯仿，加入一定体积的缓冲液，探头超声9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋转蒸发有机溶剂，在45 ℃下水化45 min。量取脂质体混悬液1 mL，10 000 r/min离心10 min，取200 μL加入考马斯亮蓝溶液900 μL，在610 nm处测定吸收度，根据标准曲线计算含量，此含量为游离药物。总药量以总投药量为准。包封率=总药量-游离药物/总药量×100%。

1.4 负载GH脂质体的鉴定 药脂比的影响：分别精密量取磷脂酰胆碱储备液900 μL (10 mg/mL),800 μL,480 μL,240 μL，总胆固醇储备液(5 mg/mL)与磷脂酰胆碱的质量比保持3∶1，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH 1mL，使磷脂与药物的比值分别为6∶1、5∶1、3∶1、3∶2，置于超声仪中18 s，将混合物置于旋转蒸发仪中去除有机溶剂，在55 ℃的PBS中水化30 min。超声时间：精密量取磷脂酰胆碱储备液900 μL(10 mg/mL)，总胆固醇储备液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超声仪中9、18、36 s，将混合物置于旋转蒸发仪中去除有机溶剂，在55 ℃的PBS中水化30 min。水化温度：分别在30 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的PBS中水化30 min。水化时间：分别在55℃的PBS中水化30、45、60 min。重复性实验：通过单因素的考察，将获得最高包封率的因素进行组合。精密量取磷脂酰胆碱储备液900 μL(10 mg/mL)，总胆固醇储备液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超声仪中9 s，将混合物置于旋转蒸发仪中去除有机溶剂，在45 ℃的PBS中水化45 min。利用动态光散射原理，对脂质体的粒径和分布进行测定。检测Zeta电势。

1.5 含有GH脂质体凝胶的制备 首先选用试管倒置法检测本凝胶相转变温度。配制一系列不同浓度三嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA聚合物溶液(10%、15%、20%、25%、30%、w/w ),取2 mL置于具塞试管中,并把试管放进水浴中，使水的液面高于聚合物溶液，水浴从15 ℃开始缓慢升温，每隔0.5 ℃将试管倾斜180°以便观察溶液的流动情况。溶液不流动时的温度即凝胶温度。每个样品测定3次，取其均值。精密称取PLGA-PEG-PLGA聚合物适量置于烧杯中，在搅拌下加入定量的蒸馏水，继续搅拌直至聚合物均匀分散，置于4 ℃冰箱内保存使凝胶充分溶胀、溶解即可得到无色透明的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝胶溶液。将一定量的负载GH脂质体在搅拌下缓慢加入溶胀完全的空白聚合物凝胶PLGA-PEG-PLGA溶液中，继续搅拌均匀即得含有药物的凝胶。

1.6 GH脂质体凝胶体外释放度的测定 采用无膜扩散法测定。药物从凝胶中的释放，对比游离药物凝胶和负载药物脂质体凝胶在PBS中的释放度。将1.0 mL游离药物和载有药物的脂质体在搅拌下分别缓慢加入到溶胀完全的空白聚合物凝胶PLGA-PEG-PLGA溶液中，37 ℃下形成凝胶，加入PBS (pH 7.4) 10 mL，随后将装有凝胶的试管放置于恒温振荡仪中，将温度控制在(37±0.5)℃,转速为100 r/min。整个溶出的过程将试管密封。在30 min，1、2、4、6、8、10、12 h等设定的取样时间点取样，取样量为1.0 mL，同时补充恒温的新鲜PBS介质1.0 mL，样品经处理后于610 nm用UV测定，计算累积释放度。

2 结果

2.1 GH脂质体制备方法的有效性 依据考察单因素得出的处方为将磷脂与GH以6∶1比例配比，探头超声9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋转蒸发有机溶剂，在45 ℃下水化45 min。为验证该处方具有较高的包封率和方法的重现性，制备脂质体5份，算出包封率和载药量，5份脂质体的包封率分别为96.22%、97.88%、97.88%、96.22%、96.93%，载药量分别为11.3%、11.54%、11.54%、11.37%、11.44%。通过多次重复实验发现，制备的脂质体包封率和载药量均较高，包封率和载药量的变化并不大，方法具有较好的重现性。脂质体主要分布在567 nm左右，具有较好的分散度(PdI=0.326)，Zeta电势在-15.48 mV。

2.2 聚合物溶液相转变温度 通过制备一系列浓度的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶液，测定其转变成凝胶的温度。10%、15%、20%、25%、30%浓度的聚合物相转变温度分别为34.0 ℃ 、34.5 ℃、32.5 ℃、32.5 ℃、31 ℃。随着浓度的增加，相转变温度逐渐降低。当质量浓度低于10%时，在37 ℃不能形成凝胶，不具有继续研究的价值。质量比为30%或高于30%时聚合物的水溶液较黏稠，一定程度上会影响通针性，最终选择15%为制备凝胶的浓度，向其中加入不同量的脂质体或游离药物。其溶液-凝胶相转变温度为34.5 ℃，且通针性较好，溶液状态澄清透明。

2.3 GH脂质体凝胶体外释放度 对比游离药物凝胶和负载药物脂质体凝胶在缓冲溶液中的释放度发现，药物具有透过PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物网状结构释放的作用，从30 min开始释放，24 h的累积释放度到47.28%。见图1。GH脂质体凝胶的释放曲线表明，药物在8 h达到最大值。见图2。

图1 游离药物凝胶的释放曲线

图2 负载GH脂质体凝胶的释放曲线

3 讨论

牵张成骨术是目前国内外口腔颌面外科领域研究较多的一种新型技术，牵张成骨的基础是在牵张间隙内能产生并形成形态和质地均较好的新的骨组织。有研究[8]表明，牵张成骨在新骨生成的同时也会有胚胎的发育、新生儿骨生长以及骨折愈合等方面的生物学特征。但由于牵张成骨的治疗时间较长和可能存在骨再生不良等问题以及患者本身骨质不良时都影响了该技术的治疗效果。因此，目前寻找促进新骨形成的方法已成为很多学者们研究的热点。在我们前期的研究中发现，骨牵张部位在创伤和牵张力的作用下，局部存在低氧和缺血的情况，细胞间质液会出现异常酸化现象，表现为pH值降低。因此，我们设想，可以利用成骨部位pH值比正常组织低的特性，制备一种在生理范围内稳定而在pH偏低的环境中不稳定的pH敏感型载体材料，以减少不良反应。PE为一种天然存在的不饱和磷脂，能够形成双层相和六角相，且两相之间转变时焓变极小。以PE为主要磷脂材料制备的脂质体能够在两相转变时产生pH敏感性，但是由于其pH敏感性较弱一直未被深入研究。因此，我们拟将具有pH敏感性的小分子物质油酸、胆固醇和PE混合制备成pH敏感脂质体，提高其pH敏感性。混合材料均为天然存在产物，在人体内可自行进行生物降解，具有较好的生物相容性和安全性，相对合成材料价格较低，开发这一制剂具有极好的前景。

然而脂质体作为自组装微粒分散制剂，存在易絮凝、药物易泄露等方面的问题，即脂质体的储存及体内稳定性欠佳。高分子聚合物药物载体具有良好的稳定性，将高分子聚合物的药物载体和基于脂质的药物载体适当结合，可制备得到包覆脂质体。包覆材料的结合能够增加脂质体双层膜的稳定性，延长脂质体在体内的存留时间和脂质体中药物的释放速度[9]。因此，我们设想将GH脂质体负载在凝胶中，对其进行二次包封，以期达到理想的缓释效果。

签于目前大部分缓释载体系统需要手术才能植入目标处，因而我们设想使用一种可注射型缓释载体系统以方便临床应用。壳聚糖基可注射型温度敏感性水凝胶，在常温下为液体状态，注射入机体后随体温的升高，凝胶由液态变为固态。此种材料是一种pH值中性的物理水凝胶，与人体内环境的酸碱度接近，并避免有机化学试剂及其他有害的物质，适合于敏感大分子如蛋白质及肽类药物的运载。能用于药物缓释载体的可注射材料中，壳聚糖与甘油磷酸钠体系(CS/GPS)是研究最多的，它可用于软组织工程[10,11]。该体系中的甘油磷酸盐也是公认的无毒生物相容性物质，因此CS/GPS体系具有良好的研究和应用前景。

pH敏感性脂质体作为一种新型的纳米靶向载体，由一种或多种对外部pH变化敏感的脂质和兼性稳定剂组成，在酸性环境中不稳定。当外部环境pH变化时(即从中性向酸性pH变化时)，pH敏感脂质体即与内吞膜融合，将内容物释放至胞质[12]。羧甲基壳聚糖(CMCT)既含有阳离子(-NH})基团，又含有阴离子(-COO-)基团，是一种两性聚电解质，具有特殊的pH敏感性。链上富含的极性基团能在脂质体表面形成亲水层,可以逃避血液中网状内皮系统的捕获。当介质偏酸性时，CMCT因荷电分子链链间静电相互作用加强，加上链内氢键与疏水基团相互作用，CMCT分子链构象产生转变，分子链卷曲程度逐步增加，形成线团。随pH升高，CMCT分子内羧基被中和形成羧酸根负离子，负电荷间的相互排斥使CMCT采取松散线团构象。若将CMCT结合于脂质体表面，由于环境pH变化引起CMCT构象的改变，会迫使磷脂双分子层发生重排，破坏脂质体膜的屏障性质，从而使内容物迅速释放，便可以实现pH敏感控释。

牵张成骨的本质是骨折愈合和骨组织的再生过程，与单纯骨缺损的修复相比，它的过程存在更加复杂的炎症反应，局部低氧严重，组织在局部缺血时，细胞内和间质液出现异常酸化现象，pH值比普通的骨折创伤更低更持久。因此，我们设想，首先将羧甲基壳聚糖结合于脂质体表面，构建具有pH敏感的纳米脂质体载体，然后用这种pH敏感纳米脂质体包裹GH，制备出pH敏感钠米脂质体包裹的GH。利用牵张成骨区域pH低于正常组织特点，通过皮下注射全身应用pH敏感钠米脂质体包裹的GH，进入血液循环后在低pH值的牵张成骨区域释放出GH并发挥作用，而在身体其他部位保持稳定，实现GH靶向归巢于牵张成骨区域，促进牵张成骨新骨形成和矿化。这样不但可以使得健康组织免受药物潜在不良作用的威胁，而且可以进一步提高靶向性，实现药物的智能控制释放。

本研究结果显示，8 h之前释放药物主要为制备脂质体过程中未包裹的药物，这一现象和所计算所得脂质体的包封率相吻合。主要是脂质体对药物有一定的保护作用，从而使延缓了药物的释放。由于GH稳定性较差，在这一过程中，药物降解速度超过药物释放速度，因此累积释放率出现下降趋势。脂质体在12 h后逐渐破坏，药物释放加快，累积释放度逐渐增加。本实验结果可见，凝胶和脂质体对药物有双重保护作用，可以起到很好的缓释效果。超过24 h后测量药物的累积释放度低于47.28%。可能原因是GH在24 h之后发生降解，导致测量值偏低，使累积释放度不准确，不能直观表现药物释放的具体情况。从现有游离药物从凝胶中的释放曲线可以看出，凝胶具有控制药物缓慢释放的作用，从而延长药物作用时间。

比较负载GH脂质体凝胶与游离药物凝胶的释放度发现，载药物脂质体凝胶中的药物释放比游离药物凝胶释放缓慢。可能的原因有以下几点：①药物包裹成脂质体之后粒径增大，比游离药物分子大，不能自由地透过凝胶，有效地延缓了药物的释放；②PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物不同分散区域分散不同溶解度的药物，对于水溶性高的药物主要分散在聚合物的亲水端(PEG端)，药物的释放以扩散为主；而脂溶性药物则在聚合物的疏水端(PLGA端)，需经过与PLGA端的解离扩散或者溶蚀才能得到释放。包裹药物成为脂质体之后，药物的脂溶性增加，在凝胶中趋向于PLGA端，延缓了药物的释放；③GH作为一类水溶性蛋白质，通常存在于脂质双分子层的内部水相中，能够很好地得到保护，也在一定程度上延缓了其的释放。

综上所述，本实验证明负载GH的脂质体凝胶比游离GH凝胶更具有缓释作用，为后续这一制剂的研究提供了前期的理论基础，也为研究和开发高效低毒的蛋白药物新剂型提供重要的实验和理论依据。