子宫内膜样腺癌组织中错配修复基因的表达变化及其相关影响因素

刘彩虹,于淑莉,武文杰

(1承德护理职业学院，河北承德 067000；2承德市妇幼保健院)

子宫内膜癌是女性最常见恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，以子宫内膜样腺癌最常见，占80%～85%，常伴有子宫内膜增生,其中子宫内膜不典型增生被认为是癌前期病变[1]。子宫内膜癌近年来呈年轻化趋势，发病率逐年上升，其中散发病例约占90%，有遗传背景的病例约占10%[2]。错配修复是细胞复制后的一种修复机制，起着维持DNA复制保真度和控制基因突变的作用，错配修复基因(MMR)缺陷引起的常染色体显性遗传病被称为Lynch综合征(LS)，其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常见发生突变的四个MMR基因。LS特征为早发性结肠癌，常同时或异时伴有其他肠外器官肿瘤，其中子宫内膜癌是其最常见的肠外肿瘤[3]。目前MMR表达和突变检测的研究主要集中于结肠癌，并且在国际上已被规范地应用于结直肠癌患者筛查[4]。但在子宫内膜癌和子宫内膜非典型增生中有关MMR的研究较少，结果尚无定论。本研究中我们应用免疫组化法检测正常周期子宫内膜、非典型增生子宫内膜以及子宫内膜样腺癌标本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表达情况，以探讨MMR缺陷与子宫内膜癌发生发展的关系及其影响因素。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取承德市妇幼保健院病理科2013年1月～2017年12月存档的石蜡包埋标本，由两位高年资病理科医师复阅切片明确诊断。严格按照WHO诊断标准，纳入研究子宫正常组织和子宫内膜样腺癌标本共200例份。其中正常周期子宫内膜标本50例份(正常组)、非典型增生子宫内膜标本50例份(增生组)、子宫内膜样腺癌标本100例份(腺癌组)。腺癌组中，年龄(53.2±6.8)岁，≤50岁25例，>50岁75例；体质量指数(BMI)≤24 kg/m2者38例，>24 kg/m2者 62例；月经初潮年龄≤13岁77例，>13岁23例；国际妇产科医师联盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期45例；合并其他部位恶性肿瘤史7例，未合并93例；肌层浸润深度：≤1/2肌层65例，>1/2肌层35例；肿瘤组织分化程度：高分化37例，中低分化63例；有淋巴结转移26例，无淋巴结转移74例。增生组中，年龄(53.9±7.2)岁，≤50岁11例，>50岁39例；正常组中，年龄(52.7±6.2)岁，≤50岁10例，>50岁40例。各组年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 MMR的检测 采用免疫组化En Vision法。严格按照试剂说明书操作，鼠单克隆抗体MLH1、MSH2、MSH6和PMS2、免疫组化En Vision试剂盒以及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。具体步骤如下：石蜡标本行4 μm厚连续切片，切片脱蜡、水化，在0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中进行煮沸热修复法修复抗原，以3% H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶10 min，洗涤后滴加一抗鼠单克隆抗体MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，以PBS代替一抗作为阴性对照，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗后滴加二抗，37 ℃孵育40 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。结果判定：MMR蛋白阳性表达的判断标准为细胞核出现棕黄色颗粒[5]。两位高年资病理科医师阅片，选取10个高倍镜视野计算阳性细胞所占比例，阳性细胞数≤10%为阴性，>10%为阳性。以一种及以上MMR蛋白阴性表达判定为微卫星不稳定性(MSI)[6]。以发生MSI的子宫内膜样腺癌判定为LS相关子宫内膜癌。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白阳性表达主要位于细胞核，为黄色或棕黄色颗粒。见图1。

图1 子宫内膜腺样腺癌患者MSI(×200)

注：MLH1蛋白阴性表达(图A)；MSH2蛋白阳性表达(图B)；PMS2蛋白阳性表达(图C)；MSH6蛋白阳性表达(图D)。

2.2 各组MLH1、MSH2、PMS2、MSH6阴性表达率及MSI发生率比较 三组MLH1和PMS2阴性表达率比较，腺癌组>增生组>正常组，P均<0.05。各组MSH2和MSH6阴性表达率比较，P均>0.05。各组MSI发生率比较，腺癌组>增生组>正常组，P均<0.05。见表1。

表1 各组MLH1、MSH2、PMS2、MSH6阴性表达率及MSI发生率比较[例(%)]

2.3 LS相关子宫内膜癌与散发癌患者临床病理特征比较 100例子宫内膜样腺癌组织中，存在MSI 38例(LS相关子宫内膜癌)，不存在MSI 62例(散发癌)。LS相关子宫内膜癌与散发癌患者相比，年龄、合并其他部位恶性肿瘤史等差异有统计学意义(P均<0.05)，浸润深度、月经初潮年龄、BMI、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移等差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 LS相关子宫内膜癌与散发癌患者临床病理参数的比较(例)

3 讨论

MMR基因系统是近年在遗传性非息肉病性结直肠癌中分离出的控制人体基因变异、维持基因稳定的基因系统。MMR基因系统蛋白能够特异性地识别并纠正DNA碱基的错误配对以及消除插入-缺失环的形成，在维持遗传稳定性和完整性方面发挥着重要作用，是人体细胞的一种安全保障体系。机体MMR功能异常可以造成细胞DNA修复错误，导致患者DNA出现MSI，促进肿瘤的发生。MSI已被公认为继癌基因和抑癌基因之后肿瘤研究方面的又一个重大进展[7]。目前MMR基因系统缺陷在结直肠癌基因研究、患病风险预测、分子机制及肿瘤预防方面均取得了很大进展[8]。子宫内膜是人体增生最活跃的组织之一，细胞中DNA复制频繁、碱基错配率较高、MMR基因系统缺失发生MSI，可能促进子宫内膜癌的发生发展。近年有关MMR基因系统在子宫内膜癌和子宫内膜不典型增生发生发展中作用的研究逐渐引起各国学者的注意，但结果不一致，尚未形成共识[9]。DNA测序是检测MSI最可靠的方法，但由于检测费用很高，在无目标人群时，临床难以广泛应用。免疫组化检测错配修复蛋白表达缺失与DNA测序检测结果之间有很高的吻合度，费用较低，易于临床广泛开展，并且灵敏性和特异性很高[6,10]。本研究中，我们通过免疫组化法检测正常周期子宫内膜、非典型增生子宫内膜以及子宫内膜样腺癌标本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表达情况，发现腺癌组MSI发生率高于其他各组，并且增生组MSI发生率高于正常组，提示MMR基因表达缺失造成的MSI在子宫内膜样腺癌的发生发展中发挥着重要作用。

迄今为止，已分离出9种MMR基因,其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常见发生突变的四个MMR基因。在DNA复制过程中，首先MSH2和MSH6相互结合形成MutS-α二聚体复合物结合到错配修复区域，再与MutL-α二聚体复合物(MLH1和PMS2互相结合形成)结合，启动DNA修复反应，切除错配修复区域的DNA片段，并重新合成DNA连接。其中任何一个MMR基因的缺失表达都将导致MMR系统功能异常，促进肿瘤的发生。近年国内外相关文献报道，子宫内膜样腺癌中四个MMR基因蛋白的表达缺失率不甚相同。各个研究报道缺失率不同的原因可能与种族、地区、年龄以及样本数量差异有关[11]。本研究中我们发现子宫内膜样腺癌中MLH1、MSH2、PMS2和MSH6阴性表达率分别为29%、10%、21%、7%，以MLH1和PMS2的阴性表达为主，与国内外研究[12～15]基本一致。进一步统计学分析，我们发现腺癌组、增生组与正常组MLH1和PMS2阴性表达率比较差异有统计学意义，但各组MSH2和MSH6阴性表达率比较差异无统计学意义，提示MLH1和PMS2的阴性表达在子宫内膜样腺癌的发生发展中可能发挥着更重要的作用。

Walsh等[16]在研究中通过免疫组化法检测4种MMR蛋白，发现至少有1种蛋白缺失在年龄<50岁的子宫内膜癌患者中比例较高。Wang等[17]报道，LS相关子宫内膜癌的显著特点是发病年龄早，对比发现LS相关子宫内膜癌患者年龄低于散发癌患者。为了进一步明确LS相关子宫内膜癌的临床发病特点及MSI发生的相关影响因素，我们进一步统计分析发现LS相关子宫内膜癌患者与散发癌患者相比，在年龄、合并其他部位恶性肿瘤史等方面差异存在统计学意义，LS相关子宫内膜癌在低龄及合并其他部位恶性肿瘤史的患者中更常见，而两组患者在月经初潮年龄、BMI、FIGO分期、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移等方面差异无统计学意义，提示MSI发生与低龄及合并其他部位恶性肿瘤有关。在临床工作中，对于低龄、合并有其他部位恶性肿瘤的子宫内膜样腺癌患者应注意筛选LS相关子宫内膜癌，对可疑LS相关子宫内膜癌应该加强随访，预防异位癌的发生，早诊断、早发现、早治疗。

综上所述，子宫内膜样腺癌发生过程中，MLH1、PMS2蛋白缺失，可导致MSI；MSI的发生与低龄及合并其他部位恶性肿瘤史有关。