壳聚糖抗大鼠皮肤衰老作用的实验研究

陈春野，胡艳艳,2，郑 彬,2，方青青,2，张敏霞，赵婉意,2，王晓凤,2，张丁叮,2，谈伟强,2@

(1.浙江大学医学院附属第四医院，浙江 义乌 322000；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院，浙江 杭州 310016)

皮肤衰老是一种持续渐进性的生理过程，直接影响皮肤的外观和功能。随着对皮肤衰老机理的深入研究, 人们不断研究和总结预防和延缓皮肤衰老的有效途径和方法。壳聚糖(chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物，也是天然存在的唯一的碱性多糖[1-2]。已有研究表明，壳聚糖可以给皮肤提供胶原蛋白等，还可以刺激加快表皮细胞的再生速度，以达到减缓衰老的效果，是优异的医用敷料及组织工程材料[1-3]。羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是亚氨基酸之一，是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，可用它衡量胶原的量作为定量指标检测皮肤的衰老程度[4-5]。本研究以自然老化的健康SD大鼠为研究对象，以大鼠背部皮肤组织匀浆中羟脯氨酸含量为指标，以及各组大鼠皮肤组织形态学的差异，来探讨壳聚糖在抗皮肤衰老方面的实际效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 壳聚糖，平均分子质量M≈106，脱乙酰度85%，浙江金壳药业有限公司(壳聚糖护肤液由本课题组研制[6]，其主要是将不同分子量的壳聚糖混合后溶于1%稀醋酸中，使壳聚糖的最终质量分数为1%)；维生素E注射液(上海通用药业股份有限公司)；0.9%NaCl溶液；羟脯氨酸标准储备液：羟脯氨酸标准品(中国科学院上海生化研究所，层析纯)，用0.01N HCl配置，1ml相当于500μg；羟脯氨酸标准应用液：1ml相当于10μg；8%硫化钠酒精溶液；柠檬酸缓冲液(PH 5～7)；氯胺-T液(0.05mol/L)；过氯酸液(3.15mol/L)；对-二甲氨基苯甲醛液(8% g/g)；6N HCl；10N NaOH；表皮分离液(EDTA法)。

1.1.2 实验动物 健康SD大鼠，重量为180g-200g，雄性，受试部位皮肤无异常。

1.2 实验方法

1.2.1 皮肤标本及皮肤消化液的制备 取6只大鼠，分笼饲养，自由饮水。大鼠背部用8%硫化钠酒精溶液脱毛后，用温和清洁剂洗净，在大鼠背部画6个1.5cm×1.5cm方格，做上标记。在相应方格内(每组药物随机在每只大鼠上涂抹2个方格，一份用于羟脯氨酸测定，一份用于组织形态学观察)，分别用滴管定量滴壳聚糖(实验组)、维生素E(阳性对照组)、生理盐水(阴性对照组)并涂抹均匀。每天涂抹一次，连续涂药30天。第31天，选取每只大鼠背部涂抹处皮肤，取得的新鲜皮肤刮去疏松结缔组织及脂肪，用表皮分离液剥去表皮，留取真皮层，用吸水纸印压组织块，至无水分在吸水纸上出现为止。如暂时不做，可放入-4℃冷冻室保存，速冻标本不影响测定结果。将组织剪碎混合，称取5mg皮肤标本，放入5ml具塞刻度试管中，加入6N HCl 2ml，至烤箱(125℃)加热2h水解，加入10N NaOH 1ml(调PH5～7)加水至5ml，制成皮肤消化液。每组均产生6份大鼠的皮肤消化液样本用于测定羟脯氨酸含量，共18份，测定羟脯氨酸含量的方法采用紫外分光光度法[7]。

1.2.2 标本吸光度测定 分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0ml羟脯氨酸溶液于5ml刻度试管中，在562nm波长测定吸光度分别测定其分光度。以羟脯氨酸含量(ng)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。取皮肤消化液0.1ml至测定管中加水至1ml；标准管取标准溶液0.5ml加水至1ml；空白加水1ml。各管加入柠檬酸缓冲液1ml和氯胺-T 1ml，混匀后放置6min，再加入过氯酸混匀，放置5min，最后加入对-二甲氨基苯甲醛液1ml，放置75℃水浴10min，取出后迅速冷却至室温。在562nm波长测定吸光度，根据标准曲线算出每个处理组的羟脯氨酸含量。

1.2.3 壳聚糖对大鼠皮肤组织形态学的影响 将1.2.1制备标本中另一份各组受试皮肤，分别用20%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠皮肤组织形态学差异。

1.3 统计学处理

本文所有数据均录入EXCEL 2016及SPSS 21.0进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线

按照1.2.2的方法，测定羟脯氨酸标准曲线。测定不同浓度羟脯氨酸测定的吸光度，以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(图1)，并计算出回归方程为：y=0.000005x-0.0027，羟脯氨酸浓度与吸光度之间的线性相关系数r=0.9601(P=0.006)，确定R2=0.9218 (P<0.01)，表明羟脯氨酸浓度与吸光度之间良好的线性相关关系。

图1 标准曲线

2.2 每组大鼠皮肤中羟脯氨酸含量的计算及统计学分析

将1.2.1中制备的皮肤消化液18份均做吸光度检测，代入上述标准曲线的回归方程，计算出每份消化液样本的羟脯氨酸含量，并计算出每组数据的均值与方差(表1)。3组数据做方差分析，先做方差齐性检验(表1)，双样本方差分析来判断方差是异质的。

然后再做t-检验，双样本异方差假设，再判断显著性差异。结果得出，实验组(壳聚糖)与阳性对照组(维生素E)两组比较，t=4.4595，P<0.01，差异极显著。阳性对照组(维生素E)和阴性对照组(生理盐水)两组比较，t=3.4287，P<0.05，差异显著。实验组(壳聚糖)和阴性对照组(生理盐水)两组变量比较，t=5.4186，P<0.01，差异极显著。方差分析结果表明3组SD大鼠羟脯氨酸方差不同(P<0.05)，见表1。

表1 3组SD大鼠皮肤羟脯氨酸含量(ng)比较

实验组，即由涂抹壳聚糖的大鼠背部皮肤制成的皮肤消化液的吸光度算出的羟脯氨酸含量与阳性对照和阴性对照相比均有差异。说明壳聚糖能显著提高大鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量。

3.2 壳聚糖对大鼠皮肤组织形态学的影响

观察HE 染色后的各组大鼠皮肤形态学差异(图2)。实验组(壳聚糖)大鼠皮肤表皮角化层变薄，真皮层变厚，胶原纤维致密丰富，腺管扩张，分泌旺盛；阳性对照组(维生素E)大鼠皮肤表皮角化层无明显变薄，真皮层无明显变厚，真皮胶原纤维较多，皮脂腺分泌较旺盛；阴性对照组(生理盐水)大鼠皮肤表皮角化层较厚，真皮层厚度较薄，胶原纤维相对稀疏，腺管无明显扩张，分泌不旺盛。

图2 各实验组大鼠皮肤组织形态学差异(HE染色)

3 讨论

皮肤皱纹是人体衰老常见表现之一。胶原纤维是皮肤真皮中的重要成分，其含量随年龄增长而明显下降，从而使皮肤松弛，弹性降低。羟脯氨酸是胶原蛋白中最重要、含量最多而且最稳定的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13%，其含量可间接反映出胶原纤维的含量，从而反映出真皮衰老程度[4]。大量研究表明，在延缓皮肤衰老的临床及实验研究中，很多制剂的抗衰机理是通过检测实验组皮肤羟脯氨酸含量的变化来体现的[4-5]。本实验检测了实验各组大鼠皮肤组织匀浆中羟脯氨酸的含量，结果表明：实验组(壳聚糖)羟脯氨酸含量显著高于阳性对照组(维生素E)及阴性对照组(生理盐水)，说明壳聚糖能显著提高大鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量，从而促进皮肤胶原蛋白合成，提示具有增强皮肤弹性，延缓皮肤衰老的作用。从壳聚糖对大鼠皮肤组织形态学影响的实验可观察到实验组相对阳性对照(维生素E)和阴性对照(生理盐水)，在形态学表现上皮肤表皮角化层变薄，真皮层变厚明显，胶原纤维更加致密丰富，腺管扩张，分泌旺盛。维生素E的抗氧化作用在大量的研究中证实具有抗皮肤衰老的作用[8-9]。无论是组织学观察还是定量检测，壳聚糖的抗大鼠皮肤衰老的能力要比维生素E更强。

壳聚糖作为一种天然高分子材料，具有资源丰富、价格便宜、安全无毒等众多优点，其应用研究不断深化。研究表明，壳聚糖具有调节免疫[10]，抑制肿瘤作用[11]，还具有抗衰老，延缓受试动物老化等作用[2,3]。

壳聚糖在医疗美容、再生医学、组织工程领域具有良好的研究前景，其抗皮肤衰老的研究目前尚少。Kong SZ等人研究了壳聚糖寡糖对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠可能的抗衰老作用，结果表明壳聚糖寡糖在D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠中具有明显的抗衰老作用，其作用机制在一定程度上与提高抗氧化防御能力，减少氧化应激和改善衰老的免疫功能有关[3]。但是，壳聚糖对皮肤的抗衰老机制仍待研究，可能与其分子内存在游离的多个氨基，作为自由基吸收剂，迅速将一个氢原子提供给自由基，从而干扰自由基链式反应有关，作为自由基清除剂，在长期应用过程中能消除或减少诱发胶原蛋白产生共价键的交联反应。关于壳聚糖抗皮肤衰老的具体机制，以及其在人体内能否得到验证，尚待进一步研究。