肝素酶、碱性成纤维细胞生长因子在非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系*

朱敏，安云霞

（河南省人民医院 呼吸与危重症学科，河南 郑州 450003）

随着对恶性肿瘤的不断研究，人们发现恶性肿瘤转移需要两个关键的步骤，突破基底膜（basement membrane, BM）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）构成的屏障以及有新的血管生成[1-2]。经研究发现[3]，肝素酶对BM、ECM中的主要物质硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）具有降解作用，还能协同碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）等多种生物因子，促进肿瘤的转移以及新生血管的生成。本文对非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer, NSCLC）患者进行研究，分析肝素酶、bFGF在NSCLC患者中癌细胞转移和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河南省人民医院2012年6月—2014年6月收治的48例NSCLC患者作为研究对象。肺癌诊断标准按中国抗癌协会编著的《新编常见恶性肿瘤诊治规范》进行判断。纳入标准：①经病理学检查和诊断符合NSCLC诊断标准[4]的患者；②均行手术治疗的患者；③年龄40～80岁的患者。排除标准：①合并其他肺部疾病的患者；②年龄在40岁以下的患者；③临床资料不全，中途随访丢失的患者。术中取患者肺癌组织样本作为观察组，取癌旁组织样本作为对照组。患者中男性31例，女性17例；年龄42～76岁，平均年龄（58.2±4.6）岁。TNM分期按国际抗癌联盟（UICC）2009年制定的第七版肺癌P-TNM分期标准进行判断：Ⅰ期患者13例，Ⅱ期患者11例，Ⅲ期患者23例，Ⅳ期患者1例。肺癌分型：其中鳞癌35例，腺癌13例。分化程度：低分化患者21例，中分化患者18例，高分化患者9例。

1.2 标本的制备

取4%多聚甲醛- 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）固定组织，原位杂交组织固定时加入1∶1 000 DEPC，常规石蜡包埋切片，切片厚度4µm。

1.3 试剂与免疫组织化学染色

以色列Insight公司生产的小鼠抗人肝素酶单克隆抗体HP-130，福州迈新生物技术开发公司生产的兔抗人bFGF多克隆抗体、Plus广谱试剂盒以及鼠抗人CD34单克隆抗体。免疫组织化学染色方法和步骤严格按照相关试剂盒说明书进行操作。常规脱蜡至水，采用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液高温高压2 min抗原修复，4℃过夜，DBA显色，苏木精复染，中性树脂封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 Western blot

肝素酶浓缩型抗体与免疫组织化学染色所用一致。采用华美生物工程公司生产的羊抗鼠IgG二抗（碱性磷酸酶标记）及NBT/BCIP试剂盒。选用Invitrogen公司生产的梯度蛋白标准。取癌旁组织剪碎，加入裂解缓冲液并搅匀，离心机低温4℃离心，13 000 r/min离心30 min，提取上清液作为细胞总蛋白。10% SDSPAGE凝胶电泳、转印，5%牛血清封闭，1∶500稀释一抗4℃过夜孵育，1∶1 000稀释二抗室温孵育1 h，NBT/BCIP显色30 min。

1.5 原位杂交

采用武汉博士德生物工程有限公司生产的肝素酶原位杂交试剂盒（MK2156）进行原位杂交。肝素酶靶基因mRNA正向引物：5'-CCAAGCTAA GATCAGCTCAGTTC-3'，反向引物：5'-CATCTAAGCGC AACTTTGGAG-3'。石蜡切片的制备和杂交均严格按照试剂盒使用说明书进行操作。从杂交液中去除探针为阴性对照。

1.6 观察指标

观察两组标本中肝素酶和bFGF的表达情况，分析肺癌组织中肝素酶和bFGF的表达与肺癌临床病理因素的关系。随访患者3年，分析影响NSCLC患者预后的危险因素。观察根据阳性判断标准，以细胞膜和细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，染色强度为阳性细胞比例评定标准。在光镜下随机抽取10个高倍视野，按每个视野100个细胞进行计数。染色强度分级[5]：0级，胞质或包膜无染色；Ⅰ级，胞质或包膜呈淡棕黄色；Ⅱ级，胞质和包膜呈棕黄色或更深。阳性细胞数分级[6]：0级，阳性细胞所占比例≤50%；Ⅰ级，阳性细胞所占比例为51%～75%；Ⅱ级，阳性细胞所占比例＞75%。两项目结果相加大于Ⅱ级为阳性病例。Westem blot结果判定[7]，阳性：转印膜出现蓝紫色条带。原位杂交以细胞群中淡棕黄色和棕黄色染色超过10%为阳性表达。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，采用Logistic回归方程进行计算，以患者生存情况作为因变量，以肺癌病理因素作为自变量，逐步筛选α入=0.05，α出=0.10，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝素酶、bFGF表达情况

观察组肝素酶阳性例数38例（79.17%），bFGF阳性例数37例（77.08%）。对照组肝素酶、bFGF均为阴性表达，观察组肝素酶、bFGF阳性表达率高于对照组（χ2=11.163和12.424，P=0.001和 0.000）。

2.2 肺癌组织中肝素酶、bFGF表达与病理因素的关系

肝素酶表达与NSCLC患者病理分期、血管浸润及淋巴结转移有关；而bFGF表达则与NSCLC患者病理分期、分化程度、血管浸润及淋巴结转移有关。见表1。

表1 肺癌组织中肝素酶、bFGF表达与病理因素的关系（n =48，例）

2.3 NSCLC患者随访情况

随访NSCLC患者3年，生存患者26例，生存率54.17%（26/48）。死亡患者22例，病死率45.83%（22/48）。

2.4 NSCLC生存和死亡患者病理资料比较

NSCLC生存和死亡患者在分化程度、血管浸润、淋巴结转移、肝素酶及bFGF表达上差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

2.5 NSCLC患者预后影响因素分析

将上述有差异因素带入Logistic回归方程分析发现，分化程度、血管浸润、淋巴结转移、肝素酶及bFGF表达均是NSCLC患者预后的影响因素。赋值说明见表3、4。

表2 NSCLC生存和死亡患者病理资料比较（n =48，例）

表3 NSCLC患者Logistic分析赋值说明

表4 NSCLC患者预后影响因素分析

3 讨论

肺癌是恶性肿瘤中发病率最高的疾病之一，占人类癌症死亡的首位，严重威胁患者生命健康。据数据显示[8]，80%以上的肺癌为NSCLC，虽然治疗技术和医疗水平不断提升，但患者预后仍然差，生存率较低。肺癌的转移和侵袭是影响患者生存的主要原因，因此研究肺癌转移、侵袭的因素成为人们关注的重点。

肝素酶是一种葡萄糖苷内切酶，可裂解细胞BM、ECM中的HSPG，从而破坏BM和ECM的完整性，使肿瘤更容易发生转移和侵袭，引起人们的注意[9]。随后研究显示，正常情况下肝素酶仅表达于免疫器官、免疫细胞、内皮细胞等[10]。但在病理状态下，肝素酶在多种恶性肿瘤中均有表达，与肿瘤细胞的转移具有密切关系[11]。本文对NSCLC患者进行研究，分析肝素酶与肺癌患者病理因素的关系，结果显示，肝素酶的表达水平与肺癌的病理分期、血管浸润及淋巴结转移具有密切关系。在苏树伟等[12]研究中发现，肝素酶表达水平与恶性肿瘤的转移情况呈正相关，根据肝素酶水平有助于预测恶性肿瘤的转移情况。在随访患者3年后分析预后情况发现，肝素酶是NSCLC患者预后的影响因素。这是由于肝素酶表达水平越高，患者越容易发生恶性肿瘤，病理分期越高，越容易发生血管浸润和淋巴结转移，导致患者生存率较低。

bFGF是一种强力促血管生成因子，具有促进新生血管生长的效果[13]。在对bFGF的研究中发现，bFGF在肿瘤组织中表达水平明显升高，且与淋巴结转移、肿瘤患者预后具有密切关系[14]。在临床研究中发现，bFGF是多种恶性肿瘤预后不良的独立危险因素[15]。本研究中表明，bFGF与NSCLC患者的病理分期、分化程度、血管浸润及淋巴结转移有关。而观察患者生存情况则发现，bFGF阳性表达率越高，患者生存率越低。这可能是由于bFGF表达水平越高，NSCLC患者越容易出现淋巴结转移和血管浸润，病理分期越高，分化程度低，促进新生血管的生成，从而降低患者生存率[16]。本研究发现bFGF与肝素酶具有较多共性，可能对NSCLC患者的预后造成共同影响，具体影响还需要进一步进行深入研究。

综上所述，肝素酶和bFGF在肺癌组织中表达水平均较高，对肺癌患者的预后造成较大影响，可能与肝素酶和bFGF能促进肿瘤细胞的侵袭和转移以及促进新生血管生成有关。而随着肝素酶、bFGF水平的升高，NSCLC患者预后不良，生存率较低。