熊果苷对黄褐斑鼠模型治疗效果及机制研究

何盾，吴芳兰，徐晓芃，廖阳英，冯浩

（1.湖南省常德市第一人民医院 皮肤科，湖南 常德 415000；2.长沙市第一医院 检验科，湖南 长沙 410005；3.湖南省人民医院 皮肤科，湖南 长沙 410005）

黄褐斑是一种临床常见的色素沉着性皮肤病，临床疗效欠佳，因好发于面部，临床研究中取材困难，对治疗结果的判断比较主观。熊果苷含有美白成分，目前临床多用于美白。本研究复制熊果苷治疗黄褐斑鼠模型，以探讨其疗效及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雌性纯白豚鼠 50 只，体重（230±30）g，购自并饲养于湖南师范大学第一附属医院动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2015-0013。

1.1.2 实验药品 熊果苷软膏购自上海新先锋药业有限公司，黄体酮（20 mg/ml）购自上海通用药业股份有限公司，用灭菌注射用水稀释。

1.1.3 实验试剂及仪器 硫化钠Na2S购自济宁百川化工有限公司，酪氨酸、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，HMB45即用型试剂盒购自上海Dako公司。DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新兰生物科技股份有限公司，Olympus系统生物显微镜（Image-Pro Plus 6.0）购自美国Media Cybernetics公司。

1.2 方法

1.2.1 模型复制 参照文献 [1-2]，以 7.5 mg/kg（相当于人用临床剂量的3倍）肌内注射20 mg/ml黄体酮注射液1次，于豚鼠后腿根部连续注射30 d。豚鼠背部模型区域皮肤呈均一稳定、边界清晰的深褐色色斑，HMB45标记的黑色素阳性细胞明显增多，呈强阳性反应，表皮基底细胞和棘细胞层中可见单个散在黑色素细胞为模型复制成功。

1.2.2 分组及给药[3]将50只豚鼠按体重随机分为5组，分别为空白组、模型组、熊果苷软膏低剂量治疗组（0.125 g/100 g）（低剂量组）、中剂量治疗组（0.250 g/100 g）（中剂量组）和高剂量治疗组（0.500 g/100 g）（高剂量组）。空白组按5 ml/kg肌内注射灭菌注射用水，其余4组均复制模型。实验前24 h将脊柱两侧及靠臀部皮肤用Na2S脱毛4 cm×4 cm，每周脱毛1次。熊果苷软膏治疗组模型复制成功当天分别按比例计算局部涂擦药物，1次/d，连续用药30 d。空白组和模型组则予以蒸馏水局部涂抹，1次/d，时间和疗程同熊果苷软膏治疗组。于末次给药1天后处死所有豚鼠，每只豚鼠于脱毛处迅速取皮肤组织2块备用。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 酪氨酸、MDA含量，SOD活性测定[4-5]所有豚鼠取备用皮肤组织1块用预冷生理盐水冲洗，除去皮下脂肪及其他结缔组织后拭干，每块皮肤组织各切取0.5 g，再分别放入盛有2.0 ml预冷生理盐水的5根小试管内，高速分散机以10 r/min的速度匀浆，持续10 s，重复1次，再以3 500 r/m速度离心15 min，取上清液。酪氨酸测定采用高效液相法，MDA测定用硫代巴比妥酸法，SOD测定用黄嘌呤氧化酶法，按试剂盒说明书检测酪氨酸、MDA含量及SOD活性。

1.3.2 皮肤黑色素细胞的病理形态学观察 所有豚鼠取备用皮肤组织1块，约2 cm×1 cm，10%多聚甲醛固定，病理组织检测，免疫组织化学染色，观察黑色素细胞染色和数目，并根据文献[4]判断阳性细胞：无，0分；＜15%，0.5分；＜30%，1分；＞30%，2分。每张切片分别观察5个视野，找到皮肤表皮和附件上皮细胞胞浆中呈现棕色反应的阳性目标后，用BX50F4北航病理图像分析系统定量分析，得到每只豚鼠5个视野黑色素阳性目标的平均面积、目标与统计场面积之比（面密度）、目标个数与统计场面积之比（数密度）、平均灰度、平均光密度及积分光密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0软件统计，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性

各组豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组豚鼠皮肤酪氨酸、MDA含量均高于空白组，SOD活性低于空白组；与模型组比较，熊果苷软膏治疗组皮肤酪氨酸、MDA含量较低，中剂量组最低；而SOD活性则升高，中剂量组最高。见表1。

2.2 各组豚鼠黑色素细胞的面积、数量及深浅度比较

各组黑色素细胞面积、数量及深浅度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表 2、3）；由图 1、2 可见，与空白组比较，模型组豚鼠皮肤黑色素沉着面积增大、黑色素细胞个数增多，光密度变大，着色变深；与模型组比较，熊果苷软膏治疗组豚鼠皮肤，黑色素沉着面积缩小、黑色素细胞个数减少，光密度变小，着色变浅，以中剂量组为最明显。

表1 各组豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比较（n =10，±s）

表1 各组豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比较（n =10，±s）

注：1）与空白组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 酪氨酸/µg MDA/（nmol，ml） SOD/（NU/ml）空白组 0.43±0.04 10.16±2.06 105.82±15.76模型组 0.68±0.06 13.30±0.97 89.11±6.71低剂量组 0.47±0.131）2） 12.04±1.791）2） 101.06±13.661）2）中剂量组 0.45±0.091）2） 11.40±0.971）2） 103.29±11.221）2）高剂量组 0.49±0.191）2） 11.75±1.791）2） 101.63±13.181）2）F值 7.129 5.449 2.676 P值 0.000 0.001 0.044

表2 各组豚鼠黑色素细胞面积、数量比较（n =10，±s）

表2 各组豚鼠黑色素细胞面积、数量比较（n =10，±s）

注：1）与空白组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 面积/µm2 面密度 个数 数密度空白组 325.27± 48.68 0.004±0.001 1.12±0.28 1.69±0.92模型组 2 364.81±617.88 0.011±0.004 3.19±1.64 5.47±1.80低剂量组 557.16±144.541）2） 0.005±0.0021）2） 2.52±0.911）2） 2.07±0.871）2）中剂量组 381.65± 55.001）2） 0.004±0.0021）2） 1.91±0.681）2） 1.91±1.041）2）高剂量组 541.52±124.821）2） 0.005±0.0011）2） 2.31±0.501）2） 1.98±1.811）2）F值 87.601 15.623 6.805 19.323 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各组豚鼠黑色素细胞深浅度的比较（n =10，±s）

表3 各组豚鼠黑色素细胞深浅度的比较（n =10，±s）

注：1）与空白组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 平均灰度 平均光密度 积分光密度空白组 111.45±10.79 0.29±0.05 225.19±84.55模型组 86.29±12.02 0.59±0.16 715.90±257.60低剂量组 100.66±11.941）2） 0.34±0.081）2） 395.27±124.721）2）中剂量组 105.22±11.661）2） 0.31±0.081）2） 300.92± 91.871）2）高剂量组 104.08±7.531）2） 0.33±0.081）2） 370.62±119.501）2）F值 7.361 16.201 15.772 P值 0.000 0.000 0.000

图1 黄褐斑鼠模型及治疗前免疫组织化学染色结果

图2 各组豚鼠治疗后HMB45免疫组织化学染色结果（×400）

3 讨论

黄褐斑是一种好发于中、青年女性的获得性色素障碍性疾病，其发病机制极为复杂，影响因素众多，可能与饮食、内分泌失调、妊娠、化妆品使用、日光照射、精神因素及避孕药等诸多因素相关[6]。

各种原因所致的皮肤黑色素的沉积，是黄褐斑表现的直接原因。黑色素是酪氨酸酶一系列氧化反应后生成。酪氨酸在酪氨酸酶的氧化作用下，在黑素小体内被氧化成多巴，多巴进一步被多巴氧化酶氧化成多巴醌，多巴醌最终在酪氨酸酶的氧化下形成黑色素。由此可见，该过程中一系列的氧化与抗氧化反应紊乱，都可能造成黄褐斑的发生、发展，而酪氨酸的增多则是黄褐斑发病的主要物质基础。当这一系列氧化反应平衡紊乱时，体内将过量生成氧自由基，并且造成SOD等抗氧化酶活性降低，造成膜脂质过氧化，形成过氧化脂质（LPO），LPO不稳定，迅速分解，产生醛类，其终产物——MDA相应随之增多，并迅速攻击磷脂及蛋白质，导致色素细胞的氧化性损伤，因而也促进了酪氨酸酶的氧化反应，使得黑色素增多，并于皮肤基底层显著堆积，此即为黄褐斑等色素性皮肤疾病的发病机制之一。故而，降低皮肤组织MDA含量，提高抗氧化酶SOD活性，对黄褐斑的预防及治疗有着重要意义。熊果苷提取于熊果叶，其抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果，现几乎垄断美白市场。它主要通过阻断多巴及多巴醌的合成，从而有效抑制黑色素的生长，以达到去除色斑的效果。有研究证实[7]，熊果苷是一种理想的脱色素药物，虽然抑制酪氨酸酶活性，但不影响酪氨酸酶的表达和合成。其脱色机制主要是在转录后阶段抑制酪氨酸酶的活性，对黑素细胞酪氨酸酶家族的3种酶的含量及分子大小均无改变[8]。熊果苷包括α-熊果苷和β-熊果苷。有文献报道[9-11]，α-熊果苷比β-熊果苷美白作用强10倍，无毒副作用，高浓度对人体细胞生长无抑制作用，对紫外线灼伤导致瘢痕效果明显。氢醌是最早并最广泛应用的美白剂，但因皮肤色素分布不均及刺激性较强，甚至可能致癌等原因，在美白甚至黄褐斑的治疗中已被限制应用。相比而言，熊果苷美白效果佳，毒副作用小，是目前临床应用最为广泛的美白剂之一，能有效抑制黑色素地生长[12]。

本研究发现，模型组皮肤酪氨酸、MDA含量升高，SOD含量降低。而模型组皮肤病理形态学观察显示黑色素沉着面积增大且色深。光密度反映物质对光吸收的多少，颜色越深，目标面积越大，则光密度值越高。熊果苷软膏治疗组皮肤酪氨酸、MDA含量降低，SOD含量升高，而低、中、高3种剂量治疗组中，豚鼠模型皮肤病理形态学观察显示黑色素沉着面积缩小、着色变浅，尤以中剂量组最为突出，说明熊果苷能有效抑制黑色素的生成，从而达到治疗黄褐斑的效果，而不同浓度的熊果苷治疗效果间有差异，本实验证明中等剂量（0.250 g/100 g）治疗效果相对明显，有研究[13]将熊果苷配制为10、50、100、500、1 000 µmol/L并与黑素细胞同时培养，结果发现50 µmol/L浓度的熊果苷对酪氨酸酶活性和黑色素抑制作用最为明显，与本研究结果一致，可能是因为熊果苷通过抑制酪氨酸酶活性起作用，浓度低时未完全抑制所有酶的活性，浓度高时因活性抑制已达到饱和状态，因而无明显变化，而中等剂量比较合适。

综上所述，熊果苷软膏主要成分是熊果苷，经实验证明它有效的增白作用，可能通过提高局部皮肤组织中SOD酶活性，明显降低酪氨酸、MDA的含量，而抑制黑色素细胞和黑色素瘤细胞的酪氨酸酶活性，从而促使皮肤细胞的氧化还原反应，减少自由基产生，抑制黑色素的形成，进而有效治疗黄褐斑，熊果苷是一种安全、有效、毒副作用小的美白剂。