神经母细胞瘤干细胞转录因子的表达与意义*

李美楠，朱秀丽，曲凡，刁玉巧

（河北医科大学第四医院 儿科，河北 石家庄 050011）

儿童神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是儿童中常见的颅外恶性实体肿瘤，起源于胚胎神经嵴，发生于交感或副交感神经系统所在部位，以肾上腺髓质最为常见[1]。其病因未明，占全部儿童恶性肿瘤死亡率的15%，诊断时多为中晚期，目前治疗效果差，预后不佳。因此，进一步研究NB的发病和进展机制，将为儿童NB的诊断和治疗提供新的理论依据，有助于提高临床疗效和改善预后。目前有学者认为儿童NB的发生与肿瘤干细胞有关[2]。本研究通过检测C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4 4种干细胞转录因子在儿童NB组织中的表达情况，分析其与病理类型、临床分期、术前有无化疗的关系以及4种干细胞转录因子表达之间的相关性，进一步探索这4种干细胞转录因子在NB发生、发展过程中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取河北医科大学第四医院儿科2007年1月至2016年3月手术切除或者活检，并经病理确诊的53例神经母细胞瘤患儿（实验组）石蜡包埋组织标本切片。其中，男性31例，女性22例；年龄1～9岁，中位年龄5岁，≤5岁的38例，＞5岁的15例。另取10例严重肾盂积水患儿手术后残余的正常肾上腺组织作为对照组，所取标本经甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。以上所有标本均经2位有经验的病理科医师独立诊断，并通过手术或影像学检查确定侵犯部位和分期。实验组根据国际INSS分期系统[3]，分为Ⅲ期20例和Ⅳ期33例；按病理分型，分为节细胞-神经母细胞瘤组19例和神经母细胞瘤组34例；按照术前是否经放化疗干预，分为术前骨髓检查明确已有骨髓浸润的化疗组33例（化疗方案按上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心制定的NB-99治疗方案[4-5]）和术前骨髓检查无骨髓浸润的未经过任何放化疗干预直接手术切除组20例。

1.2 主要试剂

C-Myc兔抗人多克隆抗体（美国Bioworld Technology公司），Klf4兔抗人多克隆抗体（美国ProSci Incorporated公司），Oct4兔抗人多克隆抗体（美国Bioworld Technology公司），Sox2兔抗人单克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒（北京中衫金桥生物公司），设对照PBS代替一抗作阴性对照，选择获得阳性切片作为阳性对照。

1.3 免疫组织化学判断标准

以下免疫组织化学结果判定在双盲下进行，随机选择5个（×20）视野，计数1 000个细胞中阳性染色细胞，细胞阳性率=（阳性表达细胞数/1 000）×100%。C-Myc、Sox2及Klf4染色阳性部位均位于神经母细胞瘤细胞核，Oct4染色阳性部位位于神经母细胞瘤细胞质。染色强度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞所占的百分比：0分为阴性（无阳性细胞），1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%。按两者乘积数将每个标本的表达强度分为4个等级：阴性（-）Ⅰ级（0、1、2分）；弱阳性（+）Ⅱ级（3、4分）；中度阳性（++）Ⅲ级（6、8分）；强阳性（+++）IV 级（9、12分）[6]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，结果以阳性率（%）表示，用连续校正χ2检验和四格表资料的Fisher确切概率法，采用Spearman等级相关分析进行相关性比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在儿童NB的表达

C-Myc、Sox2和Oct4在儿童NB的表达呈强阳性（+++）（见图1A～C），Klf4在儿童NB的表达呈阳性（++）（见图1D）。

图1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在儿童NB的表达情况

2.2 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在正常肾上腺组织中的表达

C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常肾上腺组织中的表达呈阴性。见图2A～D。

图2 C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常肾上腺组织中的表达

2.3 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在儿童NB的表达

对照组和实验组的C-Myc阳性率比较，经χ2检验差异有统计学意义（χ2=12.381，P=0.000），实验组的阳性率高于对照组；节细胞-神经母细胞瘤组和神经母细胞瘤组的阳性率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），神经母细胞瘤组阳性率高于节细胞-神经母细胞瘤组；Ⅲ期组和Ⅳ期组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）；术前化疗组和术前无化疗组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），术前无化疗组的阳性表达率高于术前化疗组；不同年龄、性别分组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组和实验组的Sox2阳性率比较经χ2检验差异有统计学意义（χ2=4.251，P=0.039），实验组的阳性率高于对照组；节细胞-神经母细胞瘤组和神经母细胞瘤组的阳性率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）；Ⅲ期组和Ⅳ期组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）；术前化疗组和术前无化疗组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），术前无化疗组的阳性表达率高于术前化疗组；不同年龄、性别分组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组和实验组Oct4的阳性率比较经χ2检验差异无统计学意义（χ2=4.307，P=0.038）；节细胞-神经母细胞瘤组和神经母细胞瘤组的阳性率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），神经母细胞瘤组的阳性率高于节细胞-神经母细胞瘤组；Ⅲ期组和Ⅳ期组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）；术前化疗组和术前无化疗组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），术前无化疗组的阳性表达率高于术前化疗组；不同年龄、性别分组的阳性表达率比较经确切概率检验差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组和实验组的Klf4阳性率比较经χ2检验差异有统计学意义（χ2=8.810，P=0.030），实验组阳性率低于对照组；节细胞-神经母细胞瘤组和神经母细胞瘤组的阳性率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），神经母细胞瘤组阳性率低于节细胞-神经母细胞瘤组；Ⅲ期组和Ⅳ期组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）；术前化疗组和术前无化疗组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异有统计学意义（P＜0.05），术前无化疗组术前化疗组的阳性表达率低于；不同年龄、性别分组的阳性表达率比较经Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1～4。

表1 对照组和实验组4种干细胞转录因子阳性率比较 %

表2 节细胞-神经母细胞瘤组和神经母细胞瘤组4种干细胞转录因子阳性率比较 %

表3 Ⅲ期组和Ⅳ期组4种干细胞转录因子阳性率比较 %

表4 术前化疗组和术前无化疗组4种干细胞转录因子阳性率比较 %

2.4 Spearman等级相关分析结果

C-Myc和Sox2在儿童NB组织中的表达呈正相关（rs=0.394，P=0.023）；Sox2和 Oct4表达呈正相关（rs=0.567，P=0.010）；C-Myc与Oct4的表达无相关（rs=0.351，P=0.250）；C-Myc和Klf4表达呈负相关（rs=-0.586，P=0.000）；Sox2和klf4表达呈负相关（rs=-0.585，P=0.000）；Oct4和Klf4表达呈负相关（rs=-0.630，P=0.000）。

3 讨论

随着对肿瘤研究的不断深入，发现在肿瘤细胞中存在一小部分细胞，即TSCs细胞（tumor stem cells）与干细胞具有相似的生长调控机制，具有不断自我更新、多向分化及高度致瘤能力。其数量虽然极少，但是在恶性肿瘤发生、进展、转移、化疗耐药及复发中起着重要作用，是肿瘤发生、发展、转移及复发的根源[7]。自2006年日本科学家TAKAHASHI等[8]应用Sox2、Klf4、Oct4和C-Myc形成诱导性多潜能干细胞（induced human pluripotent stem cell, iPS）以来，上述4种胚胎性干细胞转录因子与各种类型的干细胞的研究不断更新，而他们是否参与并促进肿瘤的发生、发展，尚待研究。有相关文献报道，Oct 3/4及Sox2之间可形成复合体调控下游基因表达，同时与其他基因相互作用，将LIF/Stat3，Wnt/β-catenin，JAK/STAT3，PI3K/AKT等信号通路联系在一起，构成调控胚胎发育的信号传导网络，并在该网络中发挥核心调控作用[9-14]。C-Myc蛋白是发现最早的与肿瘤细胞增殖活性相关的原癌基因产物之一，介导细胞外传入细胞内的生物信号向细胞核内传递，参与细胞增殖和细胞凋亡的调控[15-18]，与多种肿瘤的发生、发展有关，如肾癌[19]、乳腺癌[20]、食管癌等[21]。大多数研究都表明Sox2的过表达与肿瘤的恶性生物学行为及预后不良密切相关。KIM等[22]研究发现，在诱导性多能干细胞的形成过程中所需的众多基因，如Oct3/4、Sox2、Klf4、C-Myc等，只有Oct4是形成多潜能性干细胞唯一不可缺少的基因。随着对肿瘤的深入研究，众多学者发现Oct4在肿瘤的发生、发展过程中也发挥重要作用，并与肿瘤干细胞关系密切。YANG等[23]在神经母细胞瘤I型细胞系的研究中证实，下调Oct4的表达可以诱导肿瘤细胞的分化。以上研究成果均提示，Oct4的高表达与肿瘤的高度恶性有关，可能成为判断预后的指标。本实验在分析儿童NB组织中C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4的表达情况以及彼此之间的相关性中发现，这4种因子在NB组织中的表达均为阳性，C-Myc与Sox2、Oct4与Sox2在儿童NB组织中的表达呈正相关，而C-Myc与Oct4的表达无关，提示C-Myc、Oct4与Sox2在儿童NB的发生、发展过程中相互协同发挥作用。Klf4与C-Myc、Oct4、Sox2在儿童NB组织中的表达呈负相关，提示Klf4与C-Myc、Oct4、Sox2在儿童NB的发生、发展过程中发挥作用是相互拮抗的。实验发现C-Myc和Oct4在节细胞-神经母细胞瘤组织中的表达低于其在神经母细胞瘤组织中的表达，Klf4的表达则与之相反，提示C-Myc、Oct4、Sox2可能与儿童NB组织的分化程度相关，可能成为判断预后的指标。因此，可设想在未来的研究中尝试通过下调Oct4和C-Myc的表达诱导儿童NB向分化良好的类型分化，降低其恶性程度，改善预后。Klf4在人体内多种组织和细胞中广泛表达，参与多种生理功能，如胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡、维持干细胞的全能性[24-25]等。Klf4在肿瘤的发生、发展及转移过程中，作为抑癌基因或癌基因，发挥着完全不同的作用。如Klf4可以维持乳腺癌肿瘤干细胞的自我更新，促进癌细胞的侵袭和转移，发挥癌基因作用[26]。本研究中C-Myc、Oct4及Sox2在术前未行化疗组的儿童NB组织中的表达均高于其在术前化疗组的表达，而Klf4在术前未行化疗组儿童NB组织中的表达低于其在术前化疗组的表达，提示化疗药物对C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4的表达有影响，推测 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4可能与化疗药物发挥作用的机制相关，可反映儿童NB的化疗效果，作为判断治疗疗效的指标，有望成为NB治疗的新靶点。C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在NB组织中的表达与年龄、性别及临床分期无关。本研究只是发现干细胞转录因子C-Myc、Sox2、Oct4及Klf4在儿童NB组织中的表达现象，还需进一步研究其与神经母细胞瘤的发生、发展相关的机制，探索更为有效的治疗方法以降低儿童NB的恶性程度，提高化疗疗效，改善NB患儿预后。