宫颈鳞癌组织中c-fos蛋白表达与HPV感染的相关性*

张玉芳，任春丽，梁爽，张金环，郭艳巍，侯敬

（承德医学院附属医院 妇产科，河北 承德 067020）

目前研究者认为宫颈癌的发生与持续的人乳头状瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染密切相关。特别是高危型HPV（HPV16、18、31、45等）的持续性感染，是宫颈癌发病的主要原因[1-2]。原癌基因c-fos是即刻早期基因家族中的一员，其在肿瘤的侵袭、细胞外基质的降解、异常黏附及转移灶新生血管形成等多个环节中发挥重要作用[3]。本研究通过检测宫颈鳞癌和宫颈病变组织中c-fos蛋白表达和HPV的感染情况，探讨c-fos是否与HPV感染协同参与宫颈鳞癌发生发展过程。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取承德医学院附属医院妇科门诊及病房2012～2016年经病理确诊为宫颈鳞癌和癌前病变的标本共148例。患者年龄25～64岁，平均48.2岁，其中，＜45岁患者68例，≥45岁患者80例。依据病理学诊断结果为慢性宫颈炎症组（31例）、低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL）组（35例）、高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL）组（33例）及宫颈鳞状细胞癌组（49例）。宫颈鳞癌组中，＜45岁患者18例，≥45岁患者31例。按肿瘤分化程度：高分化16例，中低分化33例。有淋巴结转移19例，无淋巴结转移30例。

1.2 方法

1.2.1 宫颈鳞癌组织HPV-DNA含量的检测 采用PCR-反向点杂交技术检测宫颈鳞癌组织HPV DNA含量，应用HPV-DNA检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）进行检测，严格按照试剂盒操作说明书进行HPV-DNA提取、PCR扩增、杂交、洗膜及显色。

1.2.2 结果判读 阳性质控品杂交膜条在相应的HPV基因型位点及IC位点出现显色信号（蓝色斑点），其他位点不显色；阴性质控品杂交膜条除IC位点出现显色信号外，其他位点不显色。按照膜条上探针排列顺序，依据显色信号的有无判读结果，依据显色信号的位置判定HPV基因型。

1.2.3 宫颈鳞癌及宫颈病变组织中c-fos蛋白表达的检测 采用免疫组织化学PV二步法检测宫颈鳞癌及宫颈病变组织中c-fos蛋白表达，一抗为c-fos兔抗多克隆抗体，稀释浓度为1︰100，以PBS代替一抗做为阴性对照，已知阳性结果做阳性对照。c-fos抗体和免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。采用阳性细胞的百分率评分和染色强度评分进行结果判定，每个标本选取6张切片，每张切片均随机取3个视野测量，取平均值。①阳性细胞百分率评分标准：无表达或阳性细胞数计分，＜5%=0分，6%～25%=1分，26%～50%=2分，≥51%=3分；②染色强度评分标准：基本不染色=0分，染色较浅=1分，染色适中=2分，染色较深=3分。将阳性细胞百分率评分和染色强度评分得分之和作为最后得分：≤1分为阴性（-）；2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。按抗体说明书标示，c-fos蛋白主要表达于胞核，偶尔散在表达于胞质，单纯胞质表达不视为阳性。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染与宫颈鳞癌临床特征阳性的关系

HPV在49例宫颈鳞癌组织中的表达率为89.8%，PCR-反向点杂交方法检测结果显示：膜条上分别于16、35、58位点出现显色信号，即宫颈鳞癌患者HPV感染主要为HPV16型，少数为HPV35型和HPV58型。不同年龄、肿瘤分级及临床分期患者宫颈鳞癌组织中HPV感染比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。宫颈鳞癌淋巴结转移组HPV感染与无淋巴结转移组比较，差异也无统计学意义（P＞0.05）。见图1和表1。

2.2 宫颈鳞癌及宫颈病变组织中c-fos蛋白表达情况

图1 宫颈鳞癌组织中HPV分型检测结果

表1 宫颈鳞癌组织中HPV感染与临床病理特征的关系

c-fos蛋白在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL及宫颈鳞状细胞癌组织中均有表达。c-fos蛋白表达随宫颈病变的程度逐渐增加，经Spearman等级相关性分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2和表2。

图2 各组宫颈病变组织中c-fos蛋白表达情况

表2 各组宫颈病变组织中c-fos蛋白表达情况

2.3 c-fos蛋白表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系

Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中c-fos蛋白表达阳性率与Ⅲ、Ⅳ期癌组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ期低于Ⅲ、Ⅳ期；c-fos蛋白在高、中、低分化肿瘤组织中出现异常表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；有淋巴结转移组c-fos蛋白表达与无淋巴结转移组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组；c-fos蛋白表达与患者年龄无相关（P＞0.05）。见表 3。

2.4 HPV感染与c-fos蛋白表达的相关性

在宫颈鳞癌组织中（49例），HPV阳性患者（44例）c-fos蛋白阳性表达34例，阳性表达率为77.3%（34/44），HPV阴性患者（5例）c-fos蛋白阳性表达1例，阳性表达率为20.0%（1/5），两者比较，差异有统计学意义（χ2=4.680，P=0.003）。

表3 宫颈鳞癌组织中c-fos蛋白表达与临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌是一种可以通过早期筛查、早期干预有效降低发病率及病死率的一种疾病[4]。而在我国对于宫颈病变的筛查重视程度不足，加上受到地区、技术条件、费用等方面的限制，造成宫颈病变的筛查并不规范，这使得宫颈病变发生进展，进而向癌变的方向转化，因此导致我国宫颈癌的病死率仍居高不下，并且逐渐呈现年轻化的趋势，严重影响了女性的健康。

c-fos是fos家族中研究最多的基因之一，其可作为调控细胞增殖、分化、凋亡的重要基因。当细胞受到外界刺激使核内c-fos激活时，其转录的mRNA由胞核进入胞浆，转录出蛋白质后返回胞核与c-jun蛋白形成转录激活蛋白1（activator protein-1, AP-1），AP-1通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路在与基因启动子和增强子相互作用的诱导下，导致下游靶基因的过表达，促进细胞增殖及恶性转化，促使肿瘤的形成进展[5]。目前研究表明，c-fos过表达或异常表达与卵巢癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、大肠癌等多种肿瘤的发生、发展相关[6-7]。本研究通过免疫组织化学法检测c-fos蛋白在宫颈鳞癌及宫颈病变黏膜组织中的表达，发现c-fos蛋白阳性表达率随着宫颈病变程度的加重而逐渐增加。说明c-fos基因的过度激活在宫颈鳞癌的发生发展过程中发挥了重要的作用。在宫颈鳞癌组织中，c-fos蛋白表达与癌组织的分级、临床分期及有无淋巴结转移密切相关，c-fos参与了宫颈鳞癌的分化、转移过程。c-fos表达越明显，宫颈鳞癌的恶化、转移的潜在可能性也越强。因此，c-fos可能为预测宫颈鳞癌恶化、转移提供新的靶点。

HPV持续感染在宫颈上皮内瘤变过程中发挥着重要的作用，而其中HPV16和HPV18是导致宫颈癌发生的两个重要亚型。宫颈病变细胞内染色体常通过HPV基因的整合启动E1、E2基因的表达，而E6、E7癌基因与抑癌基因的结合并使其失活可促进宫颈上皮病变的发生[8-10]。有研究发现[11]，体内细胞在受到HPV感染后，体内c-fos与c-jun表达升高，激活AP-1信号通路，并通过调控下游靶基因，促进肿瘤细胞的增殖、血管的形成、肿瘤的转移等。本研究通过PCR-反向点杂交技术检测宫颈鳞癌组织中HPV-DNA含量，发现HPV在宫颈癌组织中的表达率高达89.8%，主要为HPV16型，少数为HPV35型和HPV58型，与以往研究结果一致。推测HPV感染可能是导致宫颈癌变的重要因素之一。在宫颈癌组织中，HPV阳性患者c-fos蛋白表达率均高于HPV阴性患者，提示c-fos的表达增强进而激活AP-1信号通路可能是HPV感染后引发宫颈癌重要因素，但确切机制尚有待于进一步研究。因此，联合检测HPV与c-fos蛋白表达有望成为宫颈病变的早期筛查、预后评判及治疗的新手段。