康普瑞汀磷酸钠对U87细胞增殖和迁移的影响以及信号通路研究

郭曼岚，刘蔚雯，勾梦壮，刘亚伟，陈腾祥

1贵州医科大学基础医学院生理学教研室//贵州省干细胞重点实验室，贵州 贵阳 550009；南方医科大学2第一临床医学院，3南方医院神经外科//精准神经外科实验室，广东 广州 510515

胶质瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤，平均无进展生存期仅6月[1-2]，表现出恶性侵袭性和不良预后[3]。手术联合治疗和化疗是治疗原发性胶质瘤的主要治疗方法[4]。目前，替莫唑胺（TMZ）是用作神经胶质瘤治疗的一线治疗药物，但转移性胶质瘤治疗方面进展甚微，主要是由于癌细胞对化疗的抵抗[5-7]。因此，寻找一种新的药物是迫切需要的。康普瑞汀磷酸钠（CA4P）是一种微管蛋白结合的肿瘤血管破坏剂，对肿瘤血管系统显示有效和选择性毒性[8-9]。CA4P已经过广泛临床试验，且在使用多种模式的临床前研究中进行了评估[10-11]，对多种恶性肿瘤具有抑制作用。有文献报道，CA4P引起快速，暂时的肿瘤血管关闭，并导致大鼠脑肿瘤异种移植物中的肿瘤灌注减少[12]。在体外，CA4P增加脐带静脉内皮细胞通透性，同时主要通过破坏VE-钙粘蛋白/β-连环蛋白/Akt信号传导途径来抑制内皮细胞迁移和毛细血管形成，从而导致快速血管崩解和肿瘤坏死[13]。同时，CA4P能够体外抑制人早幼粒细胞，人非小细胞肺癌细胞，人肝癌细和，人宫颈癌细胞等的增值活性和影响人晶状体上皮细胞增殖及迁移[14-16]。但是，对于CA4P作用胶质瘤的体外研究很少。本研究将CA4P应用于体外培养的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87，表明CA4P的抗肿瘤作用主要是通过抑制增值和迁移，可为临床化疗用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质瘤U87细胞购买自ATCC细胞库。CA4P购自上海蒽桂生物科技有限公司，溶于二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）配制成10 mmoL/L保存液。DMEM，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco，胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自美国Hyclone。CCK-8试剂盒购自日本，DAPI购自美国ROCHE。E-Cadherin、GAPDH兔一抗和兔二抗、Path Scan Intracellular Signaling Array Kit购自于Cell Signaling Technology。

1.2 细胞培养

人胶质瘤U87细胞常规复苏后，贴壁培养在含10% FBS、100 U/L青霉素和链霉素的DMEM细胞培养基中，放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。培养3 d消化传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8细胞活力检测

取对数生长期的细胞消化铺于96孔板中，5×103/孔。12 h后，分别用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激细胞。设置3个复孔，在分别刺激1、2、3、4、5 d后，吸弃原细胞上清，每孔加入110 μL（含10 μL cck-8试剂）培养基，在培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nmol/L处的A值。得到的数值用SPSS 22.0统计并用graphpad软件得到折线图。

1.4 划痕和transwell迁移实验

取对数生长期的细胞消化铺于6孔板中，3×105/孔，12 h后，用20 μL的枪头在单层细胞上沿垂直方向呈“一”字划痕，用PBS洗掉漂浮的细胞后，加入无血清的DMEM培养基（分别含0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P），培养24 h后用倒置显微镜下拍摄3个划痕区域。细胞消化铺105个于transwell小室中，上室为DMEM，下室含10%FBS的DMEM，12 h后细胞用甲醇固定5 min，晾干，DAPI染5 min，荧光显微镜下取6个视野拍照。

1.5 Western blot及pathscan检测

将U87细胞铺于10 cm培养皿，分别用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激24 h后，收集细胞总蛋白。用BCA法测定蛋白的浓度，制备10%SDSPAGE凝胶，电泳，转膜，封闭后4℃孵育一抗过夜。TBST洗3遍，室温孵育二抗1 h，TBST洗3遍，发光液进行显影。使用Path Scan Intracellular Signaling Array Kit试剂盒检测细胞信号通路。取对数生长期的U87细胞铺于10 cm细胞培养皿中，分别给予0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P刺激24 h，按照Path Scan Intracellular Signaling Array Kit试剂盒说明书进行蛋白提取，孵育，于Kodak Image Station 2000MM成像系统进行显影。

1.6 统计分析

用Image J软件测量灰度值，所有的数据用SPSS 22.0软件进行两个独立样本t检验分析，P＜0.05为差异具有统计学意义，统计图和折线图用Excel软件。

2 结果

2.1 CA4P抑制U87细胞增殖

CA4P作用U87细胞24内，各组间U87细胞活力差异不具有统计学意义（P＞0.05）。24 h后，与对照组相比6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P可以使细胞存活率降低（图1）。

图1 CA4P抑制U87细胞的增殖

2.2 CA4P抑制U87细胞迁移

细胞划痕实验表明CA4P作用U87细胞24 h后，各浓度组都能抑制细胞的迁移。其中，浓度为50、100 nmol/L时抑制最为显著（图2A）。Transwell实验同样表明，CA4P对U87细胞迁移能力的抑制作用并且具有浓度依赖性。CA4P随着作用浓度的增加抑制作用逐渐增加，10 nmol/CA4P作用U87细胞24 h后可以显著抑制细胞从上室穿过到下室（P＜0.001，图2B、C）。

图2 CA4P抑制U87细胞的迁移

2.3 CA4P使得U87细胞中E-Cadherin上调和通路激活

Western blot结果显示，不同浓度的CA4P作用细胞后，EMT标记蛋白E-Cadherin的相对表达水平随着CA4P浓度的增加逐渐升高，呈浓度依赖性（图3A）。Pathscan实验证明，不同浓度CA4P刺激后与对照组相比Akt的Ser473位点磷酸化水平升高，但是浓度为100 nmol/L时磷酸化水平降低。Bad在Ser112位点磷酸化水平升高，但是浓度为100 nmol/L时磷酸化水平没有显著改变，50 nmol/LCA4P使得细胞中SAPK/JNK在THR183/TYR18位5和GSK-3β在SER9位磷酸化水平升高，而其它浓度刺激没有显著改变。S6 ribosomal protein的Ser235/236位点磷酸化水平降低，但是浓度为50 nmol/L时磷酸化没有显著变化（图3B）。

图3 不同浓度的CA4P作用U87细胞后E-Cadherin蛋白和细胞内信号通路的变化

3 讨论

迄今为止，胶质瘤研究在基因分析水平取得了巨大进步。分子靶向药物治疗的Ⅲ期临床试验却均告失败，包括贝伐单抗也不能使患者明显获益。另外，由于胶质瘤免疫原性不强，因此对某些肿瘤疗效显著的免疫疗法如疫苗、抗体、嵌合抗原受体-T细胞治疗都没有明显进展。CA4P作为一个在临床研究中发现由于破坏血管而具有抗肿瘤活性作用的药物，对胶质瘤治疗的突破存在潜在的可能性。所以，CA4P对抗胶质瘤作用的机制探讨的研究可以为CA4P对于胶质瘤临床研究提供理论基础。

癌发生是一个多步骤的过程，其中组织结构的变化和肿瘤前结节的形成先于癌症的出现[17]。这些改变与细胞表型的改变有关，包括上皮细胞间质转化和细胞迁移，导致局部缺氧区域促进组织干细胞的存活和生长[18]以及血管生成，从而使得癌细胞不受控制的生长。缺乏正常的生长控制不仅在肿瘤早期发生而且在肿瘤转移过程中起作用。因此，有许多研究需要研究如何以及何时开始异常生长，然后利用这些知识来确定新的治疗靶点和方法。在以往的报道中，研究者发现CA4P可以抑制体外和体内很多癌症的活性[14-16]。但是，对于胶质瘤，只报道过CA4P减少大鼠脑肿瘤的皮下移植瘤的血管灌注。CA4P作用胶质瘤的体外研究很少。本研究的目标是了解CA4P对胶质瘤U87细胞的作用，结果发现CA4P抑制U87细胞的增殖和迁移，U87细胞的迁移率随着CA4P作用浓度的增加而下降，呈现浓度效应。此外，随着CA4P浓度的增加，细胞中E-Cadherin水平上调。许多的研究同样证明E-Cadherin蛋白与细胞迁移有关。例如，有研究认为原钙粘蛋白7可以通过抑制E-Cadherin抑制细胞迁移[19]，也有研究认为在前列腺癌中E-Cadherin蛋白表达上调抑制了细胞迁移[20]。

有关CA4P抑制细胞增殖的机制有各种报道。CA4P破坏线粒体膜电位，释放促凋亡的线粒体膜蛋白和DNA片段化使得急性骨髓性白血病线粒体损伤。此外，CA4P通过下调粘附分子VCAM-1的表达来减少白血病细胞与新生血管的相互作用，从而增加白血病细胞死亡[21]。CA4P引起DNA片段化的G2/M周期阻滞，诱导凋亡和自噬标记微管相关蛋白质轻链3-II蛋白水平上调介导人脐静脉内皮细胞程序性死亡。研究发现犬肿瘤组织来源的内皮细胞中VE-cadherin的表达模式异常，VE-cadherin异常表达增加了细胞对CA4P的敏感性[22]。

本研究通过实验发现CA4P抑制细胞增殖和迁移与细胞信号通路变化有关。CAP4刺激后S6 ribosomal protein的Ser235/236位点磷酸化水平降低。S6 ribosomal protein的下调显著的抑制体外细胞的增殖，促进细胞在G0-G1期阻滞[23]。Akt磷酸化抑制Ser112处的促凋亡蛋白Bad和Ser9处的多功能激酶GSK-3β活性并促进细胞存活[24-26]。JNK被归类为应激激活的激酶，并被各种应激物激活，包括氧化应激和化疗药物。已发现JNK调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其在线粒体依赖性细胞凋亡中发挥关键作用[27]。Path Scan实验研究发现用浓度为6.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上调，加大浓度为100 nmol/L时下调。以前已经证实在人类癌症中Akt磷酸化位点激活促进癌症的发生发展[24，28]。但是，本研究在Path Scan实验研究发现浓度为66.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上调，加大浓度为100 nmol/L时下调。这可能是CA4P介导信号通路间的互相调节，从而表现出不同剂量，主导细胞功能的信号通不同。

总之，CA4P抑制U87细胞的增殖和迁移和调控相关信号通路。某个信号通路的变化或者几个信号通路间相互影响调节胶质瘤细胞增殖和迁移的机制是一个复杂的过程，需要进一步深入探究。