miRNA-21过表达对乳鼠星形胶质细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

朱睿明，邢方岚，张起顺，赵 俊

河南大学淮河医院康复医学科 河南开封 475000

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢神经系统疾病，近些年的发病率呈现上升趋势[1]。星形胶质细胞(astrocytes，AS)是一种在哺乳动物脑组织广泛存在的胶质细胞，不仅可调控神经元的生长、分化及凋亡，还可通过分泌营养因子、多种激素等维持神经元的结构及功能，且在脑缺血、中枢神经系统疾病等的发生发展过程中有重要作用[2-3]。有研究[4-6]表明AS具有保护神经元、抑制损伤处炎症、建立轴突联系等功能，同时可能介导嗅鞘细胞在脊髓修复中的作用，这为SCI修复提供了新的治疗策略。miRNA(miR)在神经系统疾病及神经系统的发育、分化等过程中发挥重要作用，其中miR-21是在人类组织及细胞中发现较早、存在较为广泛的miR。有研究[7]显示，miR-21可参与缺氧缺血性脑损伤后AS活性改变，发挥增殖促进及凋亡抑制作用；miR-21在鼠AS中的过度表达可减弱SCI的肥大反应[8]。本研究旨在观察miR-21过表达对过氧化氢(H2O2)诱导的脊髓AS凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料新生SPF级1～3 d的SD乳鼠2只，体重3～5 g。FBS、DMEM培养基均购自美国Gibco公司，miR-21 mimics购自美国Dharmacon公司，MTT购自美国Sigma公司，Trizol、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司，β-catenin、c-myc和Bax抗体及HRP标记的二抗均购自美国Abcam公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2鼠脊髓AS的培养无菌条件下剪开乳鼠背部皮肤及脊柱，剪断脊髓两侧的神经根，取出脊髓放入加有PBS的培养皿内，眼科剪剥离血管和脊膜，PBS冲洗，剪碎后离心，于37 ℃水浴箱中使用胰蛋白酶消化15 min，离心，去上清，加入含体积分数15%FBS的DMEM培养基，混匀，重悬后过200目滤筛，以107～109个/L的密度转移至含体积分数15%FBS的DMEM培养基的培养瓶中，于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，将未贴壁的细胞悬液取出，以1.0×106个/mL的密度接种于培养皿，置于培养箱内培养，2～3 d换液一次，8～9 d细胞达90%融合时，于37 ℃、260 r/min振荡培养2 h以除去小胶质细胞，培养箱内放置1 h，200 r/min离心，37 ℃振荡18 h以除去少突胶质细胞，PBS洗涤，换液，1 d后胰蛋白酶消化传代。后续实验选择生长状态良好的第3代细胞。

1.3AS损伤模型的建立以0(对照)、100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2处理生长状态良好的第3代AS，24 h后，加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后弃上清，每孔中加入DMSO溶液150 μL，振荡10 min，于490 nm处用酶标仪测定吸光度(A)值，以此反映细胞活力和存活的数量。生长抑制率(IR)=(1-处理组A/对照组A)×100%。取IR接近50%的H2O2浓度为建立AS损伤模型的浓度。

1.4实验分组及处理实验分为3个处理组，空白对照组(细胞未做任何特殊处理)、H2O2组(400 μmol/L的H2O2处理AS 24 h)和miR-21+H2O2组(miR-21 mimics转染AS 24 h后用400 μmol/L的H2O2处理细胞24 h)。其中miR-21的转染参照美国Invitrogen公司的LipofectamineTM2000转染说明。

1.5qRT-PCR检测miR-21的表达收集3组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板。每组设置3个复孔，以U6作为内参基因进行PCR。反应体系：SYBR Green qPCR Mix(2×)10 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL。反应条件：首次94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 70 ℃ 40 s，共40个循环。其中miR-21及U6引物设计及合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。依据所得Ct均值，采用2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达量。实验重复3次。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡率收集上述3组细胞，预冷PBS洗涤，500 μL Binding buffer 悬浮细胞，分别加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL，室温避光反应20 min，上机前再加入Binding buffer 300 μL，1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.7Westernblot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达加入适量裂解液提取3组细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，每孔道上样40 μg蛋白，经100 g/L SDS-PAGE分离后电转至PVDF膜，用50 g/L脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入均按1∶500稀释的β-catenin、c-myc和Bax抗体，4 ℃摇床孵育过夜，洗膜，加按1∶2 000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜，ECL法显影，Quantity one 4.0软件分析条带灰度值。以目的蛋白和GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同浓度H2O2处理组AS生长抑制率，3组AS细胞间miR-21相对表达量、凋亡率以及β-catenin、c-myc和Bax蛋白表达的差异，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1H2O2对AS的毒性作用100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2对AS的抑制率分别为(25.47±1.32)%、(36.42±1.21)%、(50.17±1.03)%、(58.26±2.13)%、(66.13±2.24)%，随着浓度增加，H2O2对AS的抑制率增大(F=766.124，P<0.001)。400 μmol/L的H2O2可抑制约一半的细胞增殖，因此后续实验选择400 μmol/L为建立AS损伤模型的浓度。

2.2 3组ASmiR-21表达及凋亡率的比较结果见表1。与空白对照组比较，H2O2处理可降低miR-21的表达，诱导细胞凋亡；而转染miR-21 mimics后miR-21表达升高，细胞凋亡受抑。

表1 3组细胞miR-21的表达和凋亡率比较(n=3)

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05

2.3 3组AS细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的比较H2O2组β-catenin和c-myc的表达均低于空白对照组，Bax蛋白的表达高于空白对照组；而miR-21+H2O2组β-catenin和c-myc均高于H2O2组，Bax蛋白表达低于H2O2组。见图1、表2。

图1 3组细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达

组别β-cateninc-mycBax空白对照组0.756±0.0660.387±0.0410.061±0.007H2O2组0.152±0.016*0.126±0.014*0.289±0.028*miR-21+H2O2组0.513±0.046#0.311±0.032#0.173±0.021#F123.55555.90691.818P<0.001<0.001<0.001

*：与空白对照组比较，P<0.05；#:与H2O2组比较，P<0.05

3 讨论

AS在脊髓内含量最高，分布在脊髓的各个区域。有研究[9-10]显示，缺血性损伤、氧化应激等可引起AS凋亡，且AS的凋亡可能成为帕金森症、脑缺血等神经退行性疾病的发病机制。氧化应激是细胞内氧化平衡状态失衡现象，H2O2是人体内的主要活性氧(ROS)，有研究[11]证实，ROS可诱导神经元凋亡或坏死，参与神经元病变性疾病的发生及发展。也有研究[12-13]证实，H2O2可引起AS凋亡，而降低氧化损伤可减少AS凋亡，对于SCI治疗具有重要意义。研究[14-15]显示，miR在脊髓可塑性、发育及损伤后的病理改变中发挥重要作用，一些miR可能成为SCI后有效的干预靶点。miR-21是miR家族成员之一。有研究[8]显示，miR-21在鼠AS中的过度表达可减弱SCI的肥大反应。本研究首先使用100～800 μmol/L的H2O2处理AS，发现400 μmol/L的H2O2可抑制约一半的AS增殖，因此选择此浓度作为建立AS损伤模型的浓度。此外发现，H2O2可抑制AS中miR-21表达，而转染miR-21 mimics后AS中miR-21表达升高，过表达miR-21 可降低由H2O2诱导的AS凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路是经典信号途径，在细胞中广泛存在，参与细胞生长、分化、凋亡、能量代谢等过程的调控，在心血管疾病、癌症、神经中枢系统疾病等发生过程中有重要作用[16-18]。有研究[4]表明，Wnt/β-catenin信号通路对AS生长具有调控作用。Wnt/β-catenin信号的激活可抑制AS的凋亡[19]。Bcl-2家族是主要的凋亡调控蛋白，包括Bcl-2、Bax等，Bax主要促进细胞凋亡。研究[5，20]显示，在脑缺血再灌注大鼠海马中Bax表达下调，H2O2诱导的AS中Bax表达上调。本研究结果显示，H2O2可下调AS中Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin和c-myc表达，上调Bax表达；而过表达miR-21可上调β-catenin和c-myc表达，下调Bax表达；提示Wnt/β-catenin信号通路的激活可部分逆转H2O2对AS的损伤作用。

综上所述，过表达miR-21可降低AS凋亡，机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。该研究可能为SCI的治疗提供一定的理论依据。后续将进一步探讨miR-21对AS其他生物学特性的影响。