葛根素对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

王乐峰,周 华,刘鲁昱

1)新汶矿业集团中心医院骨二科 山东泰安 271200 2)山东大学附属省立医院血管外科 济南 250021 3)山东省立第三医院急诊科 济南 250000

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓浆细胞异常增殖的造血系统恶性肿瘤。近年来，其发病率有逐渐上升的趋势[1]。葛根素是一种从中草药葛根中提取的异黄酮，具有镇静、退热和增加冠状动脉血流量等功能，临床上多用于高血压和冠心病等心血管疾病的治疗[2]。大量研究[3-4]数据显示，葛根素有抑制白血病、胃癌和肺癌等多种肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。本研究通过观察葛根素处理后体外培养的MM H929细胞增殖及凋亡情况的变化，以期为MM的治疗提供新的线索和方向。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂和仪器H929购自美国ATCC公司，葛根素和RPMI 1640培养基购自美国Sigma公司，青链霉素双抗、胰蛋白酶和CCK-8试剂均购自太原来宝生物公司，胎牛血清购于杭州四季青公司；AKT抗体、p-AKT抗体、Bcl-2抗体、Cleaved Caspase-3抗体、GAPDH抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗均购于美国Abcam公司。总蛋白提取试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于南京凯特生物公司，流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品，酶标仪和CO2培养箱为Thermo公司产品。

1.2细胞培养将解冻复苏后的H929细胞接种到已提前加入体积分数为10%胎牛血清和100 U/mL的青链霉素双抗的RPMI 1640培养基，置于饱和湿度、体积分数5% CO2和37 ℃的细胞培养箱中培养。显微镜下观察细胞贴壁情况，当细胞占培养瓶80%左右时，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，按照1∶2比例进行传代培养。

1.3CCK-8法检测细胞的增殖情况收集生长状况良好的对数生长期H929细胞，按照3×105个/mL密度接种到96孔培养板上，分别用0、20、40和80 μmol/L葛根素处理，其中以0 μmol/L葛根素处理为对照，每组设置3个复孔；在CO2培养箱中常规培养48 h后，每孔加入CCK-8溶液 10 μL 继续培养2 h，以酶标仪检测各孔在490 nm处的光密度(OD)值。

1.4AnnexinV-FITC和PI双染法检测细胞的凋亡情况收集1.3中经葛根素作用48 h后的细胞，每组细胞设置3个重复，根据凋亡检测试剂盒说明分别加入Annexin V-FITC和PI溶液进行双染色，避光反应10 min后，上流式细胞仪检测凋亡率。

1.5Westernblot检测细胞中AKT、p-AKT、Bcl-2和CleavedCaspase-3蛋白的表达收集1.3中经葛根素作用48 h后的细胞，分别以总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒提取和定量总蛋白；向所得到的蛋白中加入Loading buffer混匀后，沸水浴变性5 min。取变性蛋白80 μg，以GADPH为内参，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。转膜后，封闭液处理2 h，分别加入一抗(AKT、p-AKT、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和GAPDH抗体，均稀释1 000倍)低温反应过夜。次日，洗膜后加入二抗反应2 h，接着加入ECL化学发光剂显影，采集图像，使用Image J软件分析条带，以目的条带与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理应用SPSS 20.0分析，各组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组H929细胞增殖和凋亡率的比较结果见表1。

表1 4组H929细胞增殖情况和凋亡率的比较

*：组间两两比较,P均<0.05

2.2 4组H929细胞中AKT、p-AKT、Cleaved-Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的比较结果见图1和表2。

1、2、3、4：分别为0、20、40、80 μmol/L葛根素处理组

c(葛根素)/(μmol/L)nAKT p-AKT* Bcl-2* Cleaved Caspase-3*030.75±0.030.56±0.031.58±0.260.09±0.022030.68±0.060.48±0.021.12±0.180.25±0.034030.71±0.050.43±0.050.87±0.050.36±0.058030.70±0.080.32±0.030.45±0.030.55±0.06F0.776 25.766 25.923 60.581 P0.539 <0.001 <0.001 <0.001

*：组间两两比较,P均<0.05

3 讨论

MM是一种发病缓慢的浆细胞疾病，目前临床上以全身化疗为主要治疗方法，但往往由于患者体质的不同，易产生恶心、呕吐和脱发等副作用。葛根素作为一种天然中草药成分，具有安全、来源广泛等优势。近年来的报道显示，葛根素可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。Yang等[5]认为，葛根素能够抑制胶质母细胞瘤U251和U87细胞增殖，诱导细胞凋亡，降低G1期细胞比例和增加S和G2/M期细胞比例。刘建军等[6]发现，葛根素通过抑制PI3K/AKT/p53信号通路，抑制骨肉瘤MG63细胞增殖和诱导凋亡。Gan等[7]指出，葛根素能够诱导细胞生长停滞和凋亡，其作用机制可能与NF-κB信号通路有关。本研究结果发现葛根素能够浓度依赖性地抑制H929细胞增殖和诱导凋亡。

PI3K/AKT信号通路是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 B (PKB/Akt)组成的信号转导通路，PI3K通过与其上游分子作用，引起PI3K构象的改变，从而磷酸化激活AKT，而活化的AKT通过调控其下游基因，参与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡过程[8]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要凋亡执行蛋白，在接受凋亡刺激时，可发生级联反应，诱导细胞凋亡；PI3K/AKT信号通路的激活能够间接抑制Caspase-3及其下游凋亡靶基因的级联反应，进而影响细胞凋亡[9]。Bcl-2是凋亡抑制基因，可与相关的促凋亡蛋白作用，引起细胞凋亡；同时Bcl-2也是PI3K/AKT信号通路下游的重要效应分子[10]。Zhu 等[11]指出，PI3K/AKT信号通路在MM细胞增殖、迁移、血管生成及耐药性等方面发挥着重要的调节作用。宋斌等[12]研究发现，MM患者血清中Bcl-2 mRNA表达明显偏高。PI3K/Akt信号通路、Caspase-3和Bcl-2的异常表达均与MM的发病和进程密切相关。本研究结果发现，葛根素处理后H929细胞中p-AKT和Bcl-2蛋白的表达水平均降低，Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高。以上结果提示，葛根素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路、上调Cleaved Caspase-3蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达，抑制H929细胞增殖和促进细胞凋亡。

总之，葛根素能够抑制MM细胞增殖并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。