黄芪多糖对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响

王 旗,吴成声 ,李 辉 ,许业传

1)铜陵市立医院普外二科 安徽铜陵 244000 2)安徽医科大学第一附属医院普外科 合肥 230022

结直肠癌是一种发生于消化道系统的常见恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率呈上升趋势，严重危害人们的健康和生命[1]。肿瘤侵袭和转移与结直肠癌患者的生存和预后密切相关[2]。黄芪多糖是从豆科植物黄芪干燥根茎中提取的主要活性成分，具有抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等多种药理学作用[3]。它可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭[4]；能够抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡[5]；可逆转食管癌细胞顺铂耐药性[6]；能够抑制视网膜瘤细胞侵袭[7]。最近有研究[8]显示，黄芪多糖可抑制人结直肠癌细胞增殖，并通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。本研究用黄芪多糖干预体外培养的人结直肠癌HCT116细胞，检测细胞侵袭和迁移能力以及相关蛋白水平的变化，探讨黄芪多糖影响结直肠癌细胞侵袭和迁移的机制。

1 材料与方法

1.1试剂来源黄芪多糖标准品购于北京索莱宝科技有限公司，纯度大于90%；人结直肠癌细胞株HCT116购于美国ATCC细胞库；DMEM培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶购于美国HyClone公司； MTT、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国Corning公司；基质金属蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)-2抗体、MMP-9抗体、β-actin抗体及辣根酶标记的二抗均购于美国Santa Cruz公司；BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；ECL发光检测试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。

1.2细胞培养HCT116细胞复苏后置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养，当细胞生长至约90%汇合度时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，以血清终止消化，吹打离心后，用新鲜完全培养液重悬细胞进行传代，取传2～3代后的细胞用于后续实验。

1.3MTT法检测HCT116细胞存活率将处于对数生长期的HCT116细胞接种于96孔板中，每孔约5×103个细胞，置于37 ℃培养箱培养。待细胞单层贴壁后，分别用含终浓度为0.0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L黄芪多糖的DMEM细胞培养液处理，每个浓度设置3个复孔。继续培养24 h后，加入MTT溶液20 μL孵育4 h，弃上清液，加入DMSO 100 μL，置摇床上避光混匀，待沉淀完全溶解后，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4划痕实验检测HCT116细胞迁移能力在超净工作台中用封口膜将6孔板封好，在板背面用Marker笔沿其直径划平行等距线，备用。收集对数期生长的HCT116细胞，接种于划线的6孔板中，接种密度为4×105个/孔，置于体积分数为5%CO2的37 ℃培养箱中培养至汇合度为80%时，进行划痕实验。用移液枪枪头在垂直于预先划线的方向进行划痕，保证枪头与板垂直，使得划痕宽度保持一致。划痕结束后加适量PBS洗去细胞碎片，分别加入终浓度为0.0、0.1、0.6 g/L的黄芪多糖，每个浓度设置3个复孔，继续培养24 h后，测量细胞迁移距离。迁移抑制率=(对照组迁移距离-实验组迁移距离)/对照组迁移距离×100%。

1.5Transwell实验检测HCT116细胞侵袭能力胰蛋白酶消化后用不含血清的培养基重悬HCT116细胞，制备单细胞悬液，将细胞浓度调整为4×105个/mL。将细胞悬液加入到上室中，再加入终浓度为0.0(对照)、0.1、0.6 g/L的黄芪多糖，每个浓度设置3个复孔。下室加入600 μL含血清的DMEM培养基。将Transwell小室置于37 ℃培养箱中孵育24 h取出，用镊子轻轻取下滤膜，以50 g/L戊二醛4 ℃固定10 min，1 g/L结晶紫染色30 min，PBS漂洗后拭去未穿过的细胞及碎片。随机选取5个视野，计数穿膜细胞数。侵袭抑制率=(对照组侵袭细胞数-实验组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%。

1.6Westernblot检测HCT116细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达将对数生长期的HCT116细胞接种于培养皿中，于37 ℃培养箱中培养24 h，换液后加入终浓度为0.0、0.1、0.6 g/L的黄芪多糖继续培养24 h，收集细胞。分别加入裂解液置冰上裂解10 min，以12 000 r/min离心10 min，提取细胞总蛋白。以BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白与上样缓冲液按体积比4∶1进行混合，置于沸水中加热变性，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。采用半干法转膜至PVDF膜上，在含50 g/L的脱脂奶粉封闭液中封闭4 h。分别加入MMP-2一抗(1∶1 000倍稀释)、MMP-9一抗(1∶800倍稀释)，4 ℃摇床上孵育过夜，TBS洗涤3次，加入二抗(1∶1 500倍稀释)，室温孵育2 h。TBS洗涤3次，以ECL试剂盒进行发光，于暗室中经凝胶成像系统扫描，采用Image J图像分析系统分析条带灰度值，以MMP-2、MMP-9条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示MMP-2、MMP-9蛋白的相对表达水平。

1.7统计学处理应用SPSS 21.0进行分析，以单因素方差分析和两独立样本t检验比较各组HCT116细胞存活率、迁移和侵袭能力、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1黄芪多糖对HCT116细胞存活率的影响结果见表1。当黄芪多糖浓度为0.8和1.0 g/L时，HCT116细胞存活率低于70%。故选择0.1、0.6 g/L的黄芪多糖用于后续实验。

表1 不同浓度的黄芪多糖对HCT116细胞存活率的影响

F=301.705，P<0.001；组间两两比较，P<0.05

2.2黄芪多糖对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响结果见表2、3，黄芪多糖能够抑制HCT116细胞的迁移和侵袭，抑制作用随浓度的升高而增强。

表2 3组HCT116细胞迁移能力的比较

*：与0.0 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05

表3 3组HCT116细胞侵袭能力的比较

*：与0 g/L组比较，P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05

2.3黄芪多糖对HCT116细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响结果见图1和表4，黄芪多糖剂量依赖性地抑制HCT116细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。

1、2、3：分别为0.0、0.1和0.6 g/L黄芪多糖组

ρ(黄芪多糖)/(g/L)nMMP-2MMP-90.030.54±0.060.92±0.110.130.33±0.04*0.52±0.06*0.630.14±0.02*#0.27±0.03*#F64.33958.283P<0.001<0.001

*：与0.0 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05；#：与0.1 g/L黄芪多糖组比较，P<0.05

3 讨论

结直肠癌是临床上常见的胃肠道恶性肿瘤之一，受饮食、遗传、环境等因素的影响，其发病率逐年上升[9]。寻找高效低毒的抗癌药物是肿瘤治疗的热点及难点[10-12]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分。相关研究[13-15]显示，黄芪多糖能够通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖，诱发细胞凋亡，阻滞肿瘤细胞周期的进程，抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。作者通过MTT实验发现黄芪多糖可抑制结直肠癌细胞增殖。本实验选取0.1和0.6 g/L的黄芪多糖干预HCT116细胞，探究黄芪多糖对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响及其作用机制。

本研究发现黄芪多糖可抑制HCT116细胞的迁移和侵袭。这与Wu等[17]的研究相似，他们发现黄芪多糖通过抑制NF-κB活性，抑制人肺癌细胞A549的转移，发挥抗肿瘤活性。黄芪多糖还通过抑制AKT信号通路抑制胃癌AGS细胞的侵袭和转移[18]。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族中主要成员，主要功能是降解和重塑细胞外基质[19]。目前研究[20]证实MMP-2和MMP-9活性或表达水平升高时，乳腺癌细胞表现出较高的侵袭性和转移性。结直肠癌的恶性生物学表型及预后与MMP-2和MMP-9的表达紧密相关，且结直肠癌细胞的侵袭和转移与MMP-2和MMP-9有关[21]。本实验结果显示，黄芪多糖能够显著下调结直肠癌细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。

总之，黄芪多糖能够显著抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移，其作用机制与下调MMP-2和MMP-9的表达有关。