假蒟对去卵巢糖尿病骨质疏松大鼠血糖、骨代谢、氧化应激的影响

杨迪 冯法博 朱丹杰 李晓林 邹成 沈洁 赵瑜

流行病学调查显示我国成年人2型糖尿病患病率为9.7%～11.6%[1]。研究表明糖尿病患者发生骨质疏松的风险明显高于非糖尿病患者，发病机制考虑为糖尿病患者破骨细胞活性增加，成骨细胞活性下降[2-4]。绝经后女性体内雌激素水平急剧降低，活性氧的增加诱导破骨细胞分化和增殖，易引发骨质疏松[5]。绝经后的2型糖尿病患者存在年龄、绝经、糖尿病等骨质疏松的多重危险因素，应成为防治骨质疏松的重点人群。假蒟来源于胡椒科植物假蒟的地上部分，研究发现假蒟叶水提取物具有较好的抗氧化活性，细胞及动物实验证实其对糖尿病、动脉粥样硬化、高血压有预防和治疗作用[6-8]。由于氧化应激在糖尿病及其并发症、骨质疏松的发病机制中起着重要作用，而假蒟具有降低血糖、抗氧化应激功能，因此推测使用假蒟能降低糖尿病患者发生骨量减少、骨质疏松的风险。本研究通过对雌性SD大鼠去卵巢手术后腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）的方法，复制伴有2型糖尿病的骨质疏松大鼠模型，旨在观察假蒟对去卵巢糖尿病骨质疏松大鼠血糖、骨代谢指标、氧化应激指标、骨小梁的影响，探讨其对去卵巢糖尿病骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制，为假蒟的临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 2月龄清洁级雌性SD大鼠50只，体质量180～200g，购于浙江省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001。所有动物于浙江省实验动物中心屏障环境饲养，使用许可证号：SYXK（浙）2014-0008。

1.2 实验药物、试剂与仪器 3kg烘干假蒟叶购自浙江省中医院，切成小片状，加入蒸馏水（每900ml蒸馏水中加入100g烘干假蒟叶）后煮沸，并以不低于80℃的温度持续煎煮3h，假蒟水提取物通过冷冻-干燥后被浓缩和干燥成粉末；密封装瓶，提取粉末在4℃冰箱保存直至使用。STZ（美国 Sigma公司），戊酸雌二醇（E2）（拜耳医药保健有限公司广州分公司），格列本脲（江苏正大天晴药业股份有限公司），TC、TG、钙（Ca）、磷（P）、骨钙素（OC）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物科技有限公司），空腹胰岛素（FINS）、糖化血清蛋白（GSP）、E2ELISA 试剂盒（杭州昊天生物科技有限公司），BX60荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），硬组织切片机（德国Leica2500E），DP70彩色数码成像系统（北京华跃英泰科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组及去卵巢糖尿病骨质疏松大鼠模型建立 50只大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为模型组、格列本脲组、E2组、假蒟组和假手术组5组，每组10只。所有大鼠用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，假手术组找到卵巢后不予结扎摘除，只切除双侧卵巢周围少许脂肪组织；另外4组用线结扎输卵管，切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松大鼠模型。术后1周，去卵巢大鼠腹腔注射STZ（35mg/kg），72h后检测空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1mmol/L作为糖尿病模型成功的标志。去卵巢糖尿病大鼠饲养10周，形成去卵巢糖尿病骨质疏松模型。

1.3.2 各组给药方法 模型组和假手术组采用0.9%氯化钠溶液灌胃，8ml（/kg·d）。格列本脲组采用格列本脲（配成0.625mg/ml浓度）灌胃，5mg（/kg·d）。E2组采用E2（配成12.5μg/ml浓度）灌胃，100μg（/kg·d）。假蒟组采用假蒟（配成15.625mg/ml浓度）灌胃，125mg（/kg·d）。各组均连续给药4周。

1.3.3 实验指标检测 药物干预结束后，禁食24h，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血并分离血清，全自动生化检测仪测量生化指标（TC、TG、Ca、P、FBG），采用 ELISA 法检测 FINS、GSP、E2、晚期糖基化终末产物（AGEs），试剂盒检测氧化应激指标（SOD、MDA）和骨代谢指标（OC、AKP）。

1.3.4 组织学检测 10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉后急性大失血法（腹主动脉取血）处死各组大鼠。取各组大鼠左侧股骨，4%多聚甲醛固定24h，20%甲酸和15%乙二胺四乙酸脱钙14d，各级乙醇脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察骨组织病理形态学改变。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后血清FBG水平比较 干预前，假手术组血清FBG水平均明显低于其他4组（均P＜0.01）。干预后，格列本脲组、假蒟组、假手术组血清FBG水平均低于模型组（均P＜0.05），格列本脲组、E2组、假蒟组血清FBG水平均高于假手术组（均P＜0.05）。干预后，假蒟组与格列本脲组血清FBG水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后，模型组、E2组血清FBG水平均较干预前升高（均P＜0.05），但格列本脲组、假蒟组、假手术组干预前后血清FBG水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.2 各组大鼠干预后生化指标比较 干预后，格列本脲组、假蒟组、假手术组血清TC水平均低于模型组（均P＜0.05），格列本脲组、E2组血清TC水平均高于假手术组（均P＜0.05）。格列本脲组、E2组、假蒟组、假手术组血清TG水平均低于模型组（均P＜0.05）。E2组、假手术组血清E2水平均高于模型组（均P＜0.05），格列本脲组、E2组、假蒟组血清E2水平均低于假手术组（均P＜0.05）。模型组、E2组血清FINS水平均低于假手术组（均P＜0.05）。模型组、格列本脲组、E2组、假蒟组血清GSP水平均高于假手术组（均P＜0.05）。但各组血Ca及P比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表1 各组大鼠干预前后血清FBG水平比较（m m ol/L）

表2 各组大鼠干预后生化指标比较

2.3 各组大鼠干预后骨代谢指标比较 格列本脲组、E2组、假蒟组、假手术组血清AKP水平均低于模型组（均P＜0.05），格列本脲组、E2组、假蒟组血清AKP水平均高于假手术组（均P＜0.05）。但各组血清OC水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠干预后骨代谢指标比较

2.4 各组大鼠干预后氧化应激指标比较 假蒟组血清SOD活性分别高于假手术组、模型组（均P＜0.05），格列本脲组血清SOD活性高于假手术组（P＜0.05）。假蒟组、假手术组血清MDA水平均低于模型组（均P＜0.05）。格列本脲组、假蒟组、假手术组血清AGEs水平均低于模型组（均P＜0.05），E2组血清AGEs水平高于假手术组（P＜0.05），见表 4。

表4 各组大鼠干预后氧化应激指标比较

2.5 各组大鼠骨组织病理形态学改变比较 与假手术组比较，模型组、格列本脲组、E2组大鼠骨松质部位骨小梁明显减少，排列稀疏、不整齐，部分断裂，模型组中这种病理变化更加严重；假蒟组骨小梁数量减少不明显，排列较规则，连续性、完整性较好，见图1。

图1 各组大鼠骨组织病理形态学改变（a：假手术组；b：E2组；c：格列本脲组；d：假蒟组；e：模型组；H E染色，×200倍）

3 讨论

高血糖是糖尿病的主要特征，糖尿病慢性并发症主要通过长期持续性高血糖和血糖波动两种方式产生，而其核心是氧化应激[9-10]。在高糖和（或）氧化应激条件下，体内脂质过氧化产物MDA和AGEs水平增加，积累的AGEs一方面可通过与其受体结合促进SOD等抗氧化酶糖基化，削弱机体清除自由基的能力，加重氧化应激及炎症反应，造成多种糖尿病慢性并发症；另一方面可通过减少成骨细胞活性，诱导破骨细胞形成和受损的骨基质矿化等影响骨重建过程，造成骨质损伤，是糖尿病骨质疏松的主要成因[11]。因此对血清MDA、AGEs水平和SOD活性持续监测可以明确氧化应激状态及评估抗氧化疗效[12]。

本研究显示药物干预后，与模型组比较，假蒟组SOD活性升高，MDA水平下降，说明假蒟具有抗氧化应激作用；格列本脲组、假蒟组血清AGEs水平均低于模型组。综上，试验结果证明假蒟可减轻氧化应激诱导的损伤，推测假蒟可能对去卵巢糖尿病骨质疏松存在改善作用。

本研究显示干预前模型组、格列本脲组、E2组、假蒟组血清FBG水平均高于假手术组，差异均有统计学意义，说明糖尿病模型成功。干预后，格列本脲组、假蒟组血清FBG水平均低于模型组，说明格列本脲、假蒟有降糖作用。干预前后格列本脲组与假蒟组血清FBG、FINS水平比较差异均无统计学意义，说明假蒟与格列本脲相比，在降糖作用方面具有非劣效性，推测假蒟可能存在促进胰岛素分泌作用。本研究中模型组大鼠出现血清TG、TC水平升高，干预后假蒟组血清TG、TC水平较模型组均下降，差异均有统计学意义，这与Mohd等[7]研究结果一致，推测假蒟可能具有降脂作用。

骨形成和骨吸收是骨代谢中两个紧密相联的过程。OC是由成骨细胞产生和分泌的一种激素样多肽，是骨形成的特异而敏感的指标，当骨更新率加快时，血中OC升高；AKP是反映骨重建指标之一；OC和AKP是目前常用的骨形成标志物。去卵巢大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加OC、AKP分泌，去卵巢骨质疏松为高转换型，而糖尿病骨质疏松为低转换型，在复合模型中，可能两者互相影响，从而导致部分指标变化不明显。本研究中，模型组血清AKP水平高于假手术组，处于高转换状态；干预后格列本脲组、E2组、假蒟组血清AKP水平均低于模型组。因此，推测假蒟具有降低骨转换，抑制骨吸收的作用。

本研究显示，与假手术组比较，模型组、格列本脲组、E2组大鼠骨松质部位骨小梁明显减少，排列稀疏、不整齐，部分断裂，模型组中这种病理变化更加严重；假蒟组骨小梁数量减少不明显，排列较规则，连续性、完整性较好。说明假蒟对去卵巢糖尿病骨质疏松具有改善作用，下一步需增加样本量对骨质疏松改善程度进行量化。

本研究结果表明，假蒟降糖效果非劣效于格列本脲，其可能通过改善高血糖状态、抗氧化应激，从而抑制去卵巢糖尿病骨质疏松模型大鼠骨代谢紊乱。