高效液相色谱-质谱联用法测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲含量

刘信奎，王萌萌，张连成，王超众△

（1.黑龙江省齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔 161005； 2.黑龙江省齐齐哈尔市第一医院中西医结合科，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

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高效液相色谱-质谱联用法测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲含量

刘信奎1，王萌萌2，张连成1，王超众1△

（1.黑龙江省齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔 161005； 2.黑龙江省齐齐哈尔市第一医院中西医结合科，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

目的建立测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲含量的高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS／MS）法。方法 采用HPLCMS／MS仪，选用Waters Atlantis T3 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 αm），以甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）为流动相，流速为0.2 mL／min，柱温为30℃，电喷雾电离（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）扫描方式。结果 该样品质量浓度在1.011～30.33 αg／mL范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.999 7），回收率为99.09%，RSD＝1.55%(n＝9)，稳定性良好。结论 该方法分析快速、专属性强、灵敏度高，可用于二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）的质量控制。

高效液相色谱-质谱联用法；二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）；格列本脲；含量；质量控制

近年来，临床应用二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）治疗2型糖尿病，已取得了较好的效果[1]。处方中格列本脲（glibenclamide）是治疗非胰岛素依赖型糖尿病有效且安全的一线药物[2]，且起效快、降糖作用强、疗效确切、价格便宜，在国内糖尿病的治疗中仍广泛应用[3-11]。2015年版《中国药典(二部)》所载二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲的含量测定方法为高效液相色谱（HPLC）法[12]16，目前笔者尚未检索到采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS／MS）法对该药品进行分析的文献报道。与HPLC法相比，HPLC-MS／MS法的专属性更强、灵敏度更高，更适用于该药品的定性鉴别和含量测定等的质量控制，也为该药品的痕量测定提供方法学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，Agilent 6460型三重四极杆质谱仪(配有电喷雾离子源、B.05.00版Masshunter色谱工作站软件，美国安捷伦公司）；BP 211D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

格列本脲对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100135-201105）；二甲双胍格列本脲胶囊（浙江莎普爱思药业股份有限公司，批次编号为1，2，3，格列本脲标示量均为1.25 mg）；甲醇（DikmaPure公司，批号为612201）为色谱纯；甲酸（天津光复科技发展有限公司，批号为20130705）为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱WatersAtlantisT3C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）；流速：0.2 mL／min；柱温：30℃；进样量：10 μL。

图1 格列本脲全扫描二级质谱图

质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测方式（MRM）进行定量分析。干燥气和雾化器均为氮气；干燥气温度：300℃；干燥气流量：20 L／min；鞘气流量：10 L／min，毛细管电压：4 500 V；喷嘴电压：2 000 V；扫描时间：0.2 s；格列本脲母离子质荷比（m／z）：495.01，子离子（m／z）：368.20，168.77，303.05；定量离子（m／z）：368.20。离子全扫描二级质谱图见图 1。可见，格列本脲打碎出了3个明显的二级碎片离子，且响应值较强，丰度比稳定，因此亦为该种化合物的专属性鉴别提供了数据依据。

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取格列本脲对照品10.11 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液（200 μg／mL）。精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：取样品20粒的内容物，精密称定，研细，称取细粉适量（约相当于格列本脲5 mg），精密称定，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

阴性对照品溶液：按质量标准中的处方比例，同法制备不含格列本脲的阴性样品，依法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，按拟订色谱、质谱条件进样测定，记录HPLCMS／MS定量离子离子流色谱图，结果见图2。可见，组分出峰的区域无干扰峰，且阴性对照基底响应值极低，表明处方中其他成分及辅料对样品的测定无干扰。

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配成格列本脲对照品系列溶液，按拟订色谱质谱条件进样分析，记录定量离子总粒子流色谱图，以格列本脲峰面积（Y）为纵坐标、格列本脲质量浓度（X，μg／mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝100 789 X-900.1，r＝0.999 7(n＝6)。结果表明，格列本脲质量浓度在1.011～30.33 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。将对照品系列溶液继续稀释，进样分析，记录信噪比（S／N）为10时格列本脲的质量浓度(即定量限)为0.4 ng／mL。

图2 格列本脲HPLC-MS／MS定量离子离子流色谱图

精密度试验：取同一对照品溶液连续进样6次，记录格列本脲峰面积。结果的 RSD为0.11%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ)(批次编号为1）6份，依法进样测定其含量。结果平均含量为97.53%，RSD为0.34%（n＝6），表明该方法重复性良好。

表1 格列本脲加样回收试验结果（n＝9）

稳定性试验：取同一供试品溶液，室温放置，分别于 0，2，4，6，8，12 h时进样测定，外标法计算含量。结果的 RSD为0.50%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ，批次编号为1）内容物20粒，研细，分别精密称取细粉适量（约相当于格列本脲5 mg），置25 mL容量瓶中，分别精密加入对照品约4，5，6 mg，各3份，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。分别精密量取续滤液5 mL，置9个100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 μL，进样测定，计算格列本脲的加样回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3批二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ），依法制备供试品溶液，进样10 μL，测定，记录定量离子离子流色谱图，按外标法计算含量。结果批次编号为1，2，3样品的含量分别为标示量的97.53%，98.30%，98.22%。

3 讨论

3.1 色谱及质谱条件选择

本研究中还分别考察了0.02 mol／L乙酸铵-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等流动相组成，结果流动相甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）的理论板数最高、质谱响应值最高，理论板数均可达6 000以上，因此采用该流动相系统作为检测条件。在对二级质谱进行优化时，格列本脲得到了稳定的碎片离子。

3.2 各国药典比较

中国药典[12]1117、欧洲药典、英国药典、日本药典收载的格列本脲含量测定方法为HPLC法和滴定法，HPLC法流动相分别为磷酸二氢铵溶液（取磷酸二氢铵1.725 g，加水300 mL溶解，用磷酸调节pH至3.5）-甲醇（3∶5），1.36%磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0）-乙腈（53∶47），由于液质联用法只可以挥发性成分作流动相，因此该系统不适用于液质联用法。与各国药典方法相比，本研究中建立的方法适用于液质联用法

分析格列本脲的含量，定量限也更低，因此能更准确、灵敏、专属地检测格列本脲的含量。

3.3 方法评价

本研究中建立了适合二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲含量的色谱系统与质谱系统，为格列本脲复方制剂的分析开发了新的条件，且该系统适用于质谱检测，能为HPLC-MS／MS法对该药品的药物代谢动力学分析等提供参考。

[1]吕宗杰，郑 永.消糖灵微丸中格列本脲的人体生物等效性研究[J].中国药业，2010，19（19）：10-11.

[2]周时光，林 雯，陈 晨，等.格列本脲纳米片的制备及溶出度考察[J].医药导报，2014，33（11）：1509-1513.

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ContentDetermination ofGlibenclamide in Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）by HPLC-M S／M S

Liu Xinkui1，Wang Mengmeng2，Zhang Liancheng1，Wang Chaozhong1
（1.Insepection and Testing Center of Qiqihar Institute for Food and Drug Control，Qiqihar，Heilongjiang，China 161005； 2.Department of Integrated Chinese and Western Medicine，The First Hospital of Qiqihar，Qiqihar，Heilongjiang，China 161005）

Objective To establish an HPLC-MS／MS method for the content determination of glibenclamide in Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）.M ethods The HPLC-MS／MS instrument was used.The samples were carried out on the Waters Atlantis T3 C18column（100 mm×2.1 mm，3 μm）.The mobile phase was composed of methanol-0.1% formic acid water（40∶60）at a flow rate of 0.2 mL／min.The column temperature was 30℃.The detection was performed with MRM using electrospray ionization（ESI）.Results A good linearity of glibenclamide was obtained in the range of 1.011-30.33 μg／mL（r＝0.999 7）.The recovery rate was 99.09%，RSD＝1.55%（n＝9），and the stability was good.Conclusion This method is fast，sufficiently selective and sensitive which provides an analytical basis for the quality control of Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）.

HPLC-MS／MS；Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）；glibenclamide；content；quality control

R927.2；R977.1+5

A

1006-4931(2017)06-0025-03

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.007

刘信奎，副主任药师，研究方向为药品质量控制，（电话）0452-2798917。

△通讯作者：王超众，副主任药师，研究方向为药品质量控制，（电子信箱）wangchaozhongkcn＠163.com。