丙泊酚与水合氯醛对亚低温大鼠海马神经元凋亡的影响比较*

何 亚，刘晓颖，邓庆华，郑小红，蒋红艳，苏湲 淇

（1.重庆市渝北区人民医院麻醉科，重庆 401120； 2.重庆医药高等专科学校，重庆 400030）

·实验研究·

丙泊酚与水合氯醛对亚低温大鼠海马神经元凋亡的影响比较*

何 亚1，刘晓颖2△，邓庆华2，郑小红2，蒋红艳2，苏湲 淇2

（1.重庆市渝北区人民医院麻醉科，重庆 401120； 2.重庆医药高等专科学校，重庆 400030）

目的比较丙泊酚和水合氯醛对亚低温大鼠神经细胞凋亡的干预作用，促进丙泊酚在临床低温麻醉手术中的合理应用。方法 选择健康雄性SD大鼠30只，随机分为水合氯醛常温组（A组）、丙泊酚低温组（B组）、水合氯醛低温组（C组），各10只。A组保持正常体温，B组和C两组低温干预30 min，各组进行心脏灌注，断头取脑，制备大鼠海马神经元组织样本，分别进行凋亡标志物Caspase-3检测及透射电镜超微结构观察，对比丙泊酚与水合氯醛对亚低温所致大鼠海马神经元凋亡的影响。结果 用平均光密度（AOD）值半定量Caspase-3蛋白的表达，结果水合氯醛低温组表达明显低于其常温组，但高于丙泊酚低温组（P＜0.01）；透射电镜结果显示，水合氯醛常温组海马区神经元有明显的凋亡小体形成，而水合氯醛低温组也有不同程度的凋亡趋势，只有丙泊酚低温组凋亡现象最轻。结论 大鼠亚低温状态海马神经元仍存在一定的凋亡现象，而丙泊酚可减少亚低温状态下海马神经元的凋亡，同等条件下水合氯醛对海马神经元的凋亡则无明显的干预作用。

丙泊酚；水合氯醛；亚低温；海马神经元；凋亡

近年来，丙泊酚的脑保护作用已被研究证实，其机制可能与抗自由基、抑制脂质过氧化反应、抑制细胞内的钙超载、抑制γ-氨基丁酸（GABA）再摄取、拮抗Na+内流、抑制经典神经递质乙酰胆碱（ACh）和儿茶酚胺类的突触传递、拮抗内皮素等多个环节有关[1-3]。也有研究表明，丙泊酚能减轻高温引起的神经元损伤[4]，但关于其对机体亚低温状态神经细胞的影响却少有报道。为此，本研究中选用水合氯醛作对照，采用免疫组化法检测大鼠在全身亚低温状态下海马神经元Caspase-3蛋白的表达，用透射电镜观察神经细胞超微结构的变化，对比丙泊酚和水合氯醛对全身亚低温大鼠海马神经元凋亡的影响，以使丙泊酚在临床低温麻醉手术中得到更好地应用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

动物：健康雄性SD大鼠30只，2个月月龄，清洁级，体质量150～200 g。由重庆医科大学动物中心提供，动物合格证号为SCXK（渝）2014-0001。自由饮食、饮水，常温下饲养1周，动物实验按国际通用实验室动物使用指南进行，符合动物实验伦理原则。

试药：丙泊酚注射液（西安力邦制药有限公司，批号为1107292，规格为每支10 mL∶100 mg）；水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，批号为20141001），使用前用蒸馏水将其配制成 10% 溶液；一抗（Caspase-3）、二抗（即用型试剂，购自Dako公司）；DAB显色试剂盒（美国Sigma公司）；PBS和TBS缓冲液。

仪器：RM2145型切片机，HI1210型展片机，HI1220型烤片机（德国Leica公司）；Philips TECNAI-10型透射电子显微镜（第三军医大学生物测试分析中心）；冰袋。

1.2 方法

将大鼠随机分为水合氯醛常温组（A组）、丙泊酚低温组（B组）、水合氯醛低温组（C组），各10只。每组中6只大鼠用于测定海马神经元Caspase-3蛋白的表达，4只用于观察海马神经元的超微结构变化。A组用10%水合氯醛按大鼠体质量以0.3 mL／100 g的剂量腹腔麻醉后保持正常体温；B组和C组分别用1%的丙泊酚按15 mg／100 g和 10%水合氯醛 0.3 mL／100 g腹腔麻醉，然后用冰袋置大鼠头部、颈部、肩部和躯干两侧[5]，使大鼠肛温逐步降至32℃并保持30 min，低温过程中用微量泵以16 mL／（kg·h）的速率腹腔补平衡盐溶液，并观察大鼠生理机能状况。

各组大鼠观察 24 h后分别进行腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏，经胸深主动脉插管，用生理盐水250 mL、4℃ 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 mL灌注后断头取脑[6]，将固定6 h后的海马组织经脱水、透明、浸蜡、包埋处理，制作成石蜡块，连续冠状切片，采用免疫组化法检测Caspase-3。按说明书操作，二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察，阳性产物为棕黄色或棕褐色，背景为蓝色。各组每张选取3个不重复视野照相（×400），用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定阳性细胞的平均光密度（average optical density，AOD）值半定量Caspase-3蛋白的表达，AOD值越大，表示Caspase-3蛋白表达越强，反之表达越弱。计算出 3个视野×3的AOD平均值，代表该组神经元的平均值。

各组随机选择4只大鼠，取小块海马组织，快速用PBS冲洗组织周围的血液等污物后立刻放入2.5%的戊二醛固定液；2～3 min后修整样品为1 mm3，并放入新鲜的3%戊二醛固定液。按常规透射电镜样品制备方法漂洗、OsO4固定、漂洗、脱水、浸透、Spon812包埋，上机，拍照[7]。

1.3 统计学处理

采用随机分组设计，应用JMTJFX简明统计分析软件对数据进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马神经元Caspase-3蛋白表达

A组海马神经元可见细胞膜和胞浆中有棕黄色或棕褐色颗粒，即有明显的Caspase-3蛋白表达（图1a）；其AOD值高于B组（P＜0.01）和C组（P＜0.05），B组与 C组 Caspase-3阳性颗粒均较少（图 1b、图 1c）；而B组Caspase-3阳性颗粒最少，AOD值低于C组（P＜0.01），3组Caspase-3 AOD值排列顺序依次为A组＞C组＞B组（见表1）。

表1 3组海马神经元Caspase-3平均光密度值比较（±s）

表1 3组海马神经元Caspase-3平均光密度值比较（±s）

注：与A组比较，αP＜0.01，αP＜0.05；与B组比较，＃P＜0.01。

组别水合氯醛常温组（A组）丙泊酚低温组（B组）水合氯醛低温组（C组）平均光密度值0.129±0.024 0.081±0.015α0.114±0.011α＃P值0.00 0.00 0.00

2.2 海马神经元凋亡情况

B组大鼠海马神经元超微结构损伤较轻，细胞大小

图1 3组海马神经元Caspase-3蛋白的表达（×400）

图2 3组海马神经元超微结构变化

正常，细胞膜完整，核圆，核仁居中，各种细胞器丰富，排列整齐无水肿（图2b）；A组与C组超微结构均发生改变，尤其是A组细胞凋亡现象明显，可见细胞皱缩、核固缩、核内染色质分布欠均匀，核仁消失，细胞质浓缩。细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图2a）；C组神经元也可见破坏，细胞核的染色质高度凝聚、不均匀、边缘化（图2c）。

3 讨论

水合氯醛为安全且临床常用的镇静剂及辅助麻醉药物，已有百年的应用历史。目前，其仍常用于儿科的高热惊厥辅助治疗，磁共振成像（MRI）和超声心电图的辅助操作中也有使用，并在许多国家被用于动物实验的麻醉。近年来的研究发现，水合氯醛可诱发RAW 264.7巨噬细胞凋亡[8-9]，但对神经细胞凋亡的影响未见报道。

细胞凋亡是受各种基因调控的程序化死亡过程，Caspase-3蛋白是Caspase蛋白激酶家族中的代表性成员，是介导细胞凋亡的核心蛋白酶，参与DNA断裂和核固缩现象的发生，在凋亡中起决定性的调控作用。Caspase-3是脑组织中表达较高的促凋亡蛋白，为凋亡途径的最终执行者[10]。因此，大鼠海马神经元Caspase-3蛋白的表达可反映细胞的凋亡情况。

本试验中免疫组化法结果显示，水合氯醛常温组（A组）有明显的Caspase-3阳性表达，但不排除水合氯醛有诱发大鼠海马神经元凋亡的可能，即水合氯醛对脑细胞无明显保护作用。因此，临床使用本药时应严格掌握适应证，注意用药剂量与用药时间，以减少不良反应的发生。

丙泊酚是短效静脉麻醉药，因其起效快，作用时间短，患者苏醒迅速而完全，不良反应少，持续输液后无蓄积作用，具有抗氧化及脑保护作用等特点，已被广泛应用于临床各科的手术麻醉[11-12]，包括头颅手术、体外循环疾病、慢性气道炎症和（或）哮喘患者的麻醉、新生儿静脉麻醉、胃肠镜检查及人工流产的诊疗，丙泊酚的脑保护作用也得到越来越多的研究证实[13-14]。

本研究中，水合氯醛低温组和丙泊酚低温组海马神经元凋亡蛋白Caspase-3的表达均减少，尤其是丙泊酚低温组表达最少，表明亚低温可减轻神经细胞的凋亡，丙泊酚则可干预亚低温大鼠神经元的凋亡。这并不代表低温对脑细胞毫无损害，在透射电镜检查中发现，水合氯醛低温组大鼠海马神经元也出现了不同程度的细胞凋亡趋势，即细胞核染色质浓缩、边聚，附着于核膜内表面，因此，低温给神经细胞带来的损伤作用仍不可忽视。而水合氯醛常温组海马神经元的凋亡现象十分明显，可见到典型的凋亡小体，说明水合氯醛并不能抑制神经细胞凋亡，加之没有低温的保护作用，故神经细胞损害最重。只有丙泊酚低温组神经细胞结构最完整，无明显的凋亡小体出现，损伤最轻，较好地表现出丙泊酚能增强亚低温状态下的神经元保护作用。

综上所述，在亚低温实现其神经细胞保护作用的同时，也应注意细胞凋亡带来的不良反应，而丙泊酚可减少亚低温状态下海马神经元的凋亡，在同等条件下，水合氯醛对海马神经元的凋亡无明显干预作用。因此，在某些临床手术中采用丙泊酚进行亚低温麻醉，不但可降低机体的基础代谢率，减少心脏做功，减少脑组织耗氧量[15]，而且也可减少因细胞凋亡所致的不良反应，增加手术的成功率。

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Effect Comparison of Propofol and Chloral Hydrate on the Apoptosis of Hippocampal Neurons in M ild Hypothermia Rats

He Ya1，Liu Xiaoying2，Deng Qinghua2，Zheng Xiaohong2，Jiang Hongyan2，Su Yuanqi2
（1.Department of Anesthesiology，Chongqing Yubei District People′s Hospital，Chongqing，China 401120； 2.Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing，China 400030）

Objective To compare the intervention effect of Propofol and Chloral Hydrate on the apoptosis of nerve cells in mild hypothermia rats，in order to promote Propofol better applied in clinical hypothermic anesthesia surgery.M ethods Totally 30 health SD rats were selected and randomly divided into normal temperature group of chloral hydrate（group A），low temperature group of propofol group（group B）and low temperature group of chloral hydrate（group C），10 cases in each group.The body temperature of group A was maintained normal，and those of group B and group C were under low-temperature intervention for 30 min，each group underwent heart perfusion，the brains were taken after decapitation to prepare the rat hippocampal neuronal tissue samples，and then apoptosis marker Caspase-3 was detected and the ultra-microstructure was observed by transmission electron microscopy to compare the influence of Propofol and Chloral Hydrate on the apoptosis of nerve cells in mild hypothermia rats.Results The semi-quantification was carried out on the expressions of Caspase-3 protein by average optical density(AOD).The result showed that the expression of Caspase-3 protein in group C was significantly lower than that in group A，but higher than that in group B（P＜0.01）；The results of the transmission electron microscopy showed that there were obvious apoptotic bodies formed in the hippocampal neurons in group A，while there were also different degreesof apoptotic tendency in group C，and the apoptosisphenomenon wasonly not seriousin group B.Conclusion There are certain of apoptosis phenomena in the hippocampal neurons in hypothermia rats，while the Propofol can reduce the apoptosis of hippocampal neurons under hypochromic condition，and the Chloral Hydrate has no obvious intervention effect on the apoptosis of hippocampal neurons at the same condition.

Propofol；Chloral Hydrate；hypothermia；hippocampal neuron；apoptosis

R965.2;R971.2

A

1006-4931(2017)06-0012-04

2016-11-24)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.004

重庆市教育委员会科学技术研究项目[KJ112502]。

何亚，主治医师，研究方向为临床麻醉学，（电话）023-61802500。

△通讯作者：刘晓颖，教授，研究方向为临床药理学，（电子信箱）liuxaoying＠163.com。