猪Nramp1基因内含子6的SNP多态性分析

付保强，彭 帅，顾亚荣，赵 倩，杜 倩，穆晓峰

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

编码猪天然抗性相关巨噬蛋白的基因（Natural resistance associated macrophage protein，Nramp1）是一个相对保守的基因，主要定位于第15号染色体长臂端，包含15个外显子和14个内含子，编码氨基酸数539[1-3]，表达于网状内皮细胞器官的巨噬细胞中，如猪的脾脏、大脑、肺脏的免疫器官，用于抵抗外来病原微生物的作用[4]。其作用机制为存在于巨噬细胞中的内吞小体通过消耗含有病原微生物吞噬体中的Fe2+和Mn2+等二价金属离子，使病原微生物缺乏合成的酶系从而使动物免受细菌等病原体的侵害[5]。由于猪Nramp1基因具有良好的特异性，因此可作为研究猪免疫疾病的候选基因之一。

前人已对猪Nramp1基因内含子6做了大量研究，杨军等[6]采用PCR-RFLP方法对3个外种猪群Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了分析，结果发现各基因型纯合度较低，具有中度遗传多态性。李娟娟等[7]通过利用PCR-SSCP方法检测了135头合作猪Nramp1基因第六内含子的多态性，共检测到5种基因型，序列比对发现10个新的核苷酸多态位点。周文兵等[8]以浦东白猪为研究对象，通过PCR技术分离和克隆Nramp1基因的第6内含子基因片段，结果发现该段基因中有3个突变点。前人研究中对Nramp1基因的多态性均采用传统的PCR-RFLP或SSCP的方法进行分析，本研究以大白猪、长白猪和杜洛克猪为

研究对象，采用一种较为快速的方法，即混合DNA扩增产物直接测序法，对Nramp1基因内含子6的SNP（单核苷酸多态性）进行筛选，为该基因遗传变异的深入研究和猪的抗病分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本研究的试验材料采自甘肃临泽新华猪场的139头大白猪、126头长白猪和115头杜洛克猪的耳组织样品，于仔猪出生1周内取样各约2 g，将其放置于75%酒精中，20℃保存，带回实验室后，利用试剂盒提取猪耳组织基因组DNA，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度。

1.2 引物设计本试验引物引用于文献报道[9]，对Nramp1基因内含子6的部分序列进行扩增，引物序列 为 F： 5'-GCCAGCTTCCACAGTCTCCAG-3'； R：5'-GGGGGTACAAAGGGGAAGAAG-3'，预期扩增片段长度为483 bp，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 D N A混合池构建及 P C R扩增各猪种随机抽取30个效果良好的样品，各取1 μL效构建DNA混合池。扩增体系20 μL，DNA模板0.8 μL。上、下游引物各 0.4 μL，2.PowerTaqPCR MasterMix 11st，ddH2O 7.4 μL。PCR条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行PCR测序于进一步分析。

1.4 数据统计分析通过Editseq软件进行测序峰图和序列对比分析，筛选猪Nramp1基因内含子6的SNP位点。各猪种测序峰图中各SNP位点的峰高利用软件MWSnap中标尺测量工具进行测量，并利用以下公式进行等位基因频率的估算：

注：fs表示SNP位点中s等位基因的频率（s=a/b），hm和hn分别表示测序峰图上该SNP位点等位基因m和n的峰高。

2 结果与分析

2.1 P C R扩增结果通过1%的琼脂糖凝胶对猪Nramp1基因内含子6进行PCR扩增产物检测，扩增产物片段大小在500 bp左右，条带清晰、无杂带、特异性良好且与目的片段长度相符（图1）。

图1 大白猪、长白猪、杜洛克猪Nramp1基因内含子6 PCR电泳结果图Fig.1The results of the PCR amplicons of the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

2.2 测序结果分析三猪种Nramp1基因内含子6测序峰图如图2所示，大白猪、长白猪、杜洛克猪在Nramp1基因内含子6上均有4个SNP位点（C111A、C225T、G296T和T297G）。

2.3 S N P等位基因频率估算利用MWSnap软件对3个品种猪测序结果SNP位点套峰的峰高进行了测量，利用公式计算出各等位基因频率，结果见表1。三猪种在C111A、C225T、G296T和T297G位点上均存在优势等位基因，分别为111位的C等位基因、225位的C等位基因、296位的G等位基因以及297位的T等位基因。

3 讨论

图2 大白猪、长白猪、杜洛克猪Nramp1基因内含子6扩增产物测序峰图及SNP位点Fig.2 Sequenceing peak of PCR products and SNP sites of the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

表1 大白猪、长白猪、杜洛克猪Nramp1基因内含子6 SNP位点各等位基因频率估算结果Table 1 The estimation result of allele frequency of every SNP sites about the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

动物疾病的发生与传染受到多种因素影响，包括外界因素和自身等因素，猪腹泻是影响养猪业的主要疾病之一。天然抗性相关巨噬蛋白基因（Nramp）对猪的疾病控制起着重要的作用。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是从基因水平对突变位点进行研究和分析，对于研究基因功能和指导疾病控制具有重要作用。吴秋菊等[10]通过酶切技术对3个品种猪Nramp1内含子6多态性进行分析，结果发现3个品种中基因型频率和基因频率分布趋近一致。吴宏梅等[11]对大白猪和松辽黑猪Nramp1基因第6内含子多态性与猪免疫抗病的相关性进行了分析，结果发现不同品种猪Nramp1基因型与免疫功能间存在着显著相关，提示Nramp1基因可作为抗病力性状筛选的主要候选基因之一。罗兴等[12]通过对大白猪Nramp1基因的单核苷酸多态性研究发现，Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响，提示Nramp1基因内含子6可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。古少波等[13]研究发现猪Nramp1基因内含子6的多态性与仔猪腹泻具有一定的相关性。这些结果都表明猪Nramp1基因内含子6与猪疾病相关，但均未对其具体的SNP进行分析。本研究利用DNA混合池直接测序的方法对3种猪Nramp1基因内含子6的SNP多态性进行分析，共筛选出4个SNP位点，这些位点的多态性有可能在猪疾病发生过程中起到一定的作用。本研究结果可作为筛选猪疾病遗传标记的理论依据，并在分子遗传和育种水平上为选育抗病能力强的猪种提供理论参考。