高效液相色谱法测定貉子肉中四环素类药物残留

李 曼，张珍珍，杨卫军，曹秀梅

（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北 秦皇岛 066000）

四环素类药物（TCs）是一类广谱抗菌药物，临床上主要用于治疗革兰氏阳性、阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体和螺旋体等病原微生物引起的感染。此外，四环素还作为生长促进剂被用在动物生产中，曾以价格低、抗菌谱广、饲料报酬高等优点而广泛应用在畜牧养殖生产上。人食用四环素残留超标的动物源食品后，药物会在人体内慢慢蓄积，当药物浓度达到一定量时，会造成人体急慢性中毒，严重影响人的身体健康[1]。目前，四环素类抗生素的主要检测方法有高效液相色谱法、微生物法和分光光度法[2]，其中高效液相色谱法应用最为广泛。采用高效液相色谱法测定鸡肉、水产品、鸡蛋、猪肉中四环素的方法已见相关报道[3-6]，而采用高效液相色谱法测定测定貉子肉中四环素类药物残留鲜有报道。

本文通过对GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》中高效液相色谱法的前处理方法进行改进[7]，以期建立更加快速准确地适用于貉子肉中四环素类药物的残留方法，对有效监控该药在貉子的养殖中的应用、评价貉肉食用的安全性具有重要意义。

1材料与仪器

1.1 仪器岛津LC-20A液相色谱仪配SPD-10A VP PLUS紫外检测器；SB-5200DT超声清洗机；3H20RI智能高速冷冻离心机；UVS-1漩涡振荡器；TTL-Ⅱ氮吹仪；SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取浓缩装置；FW100高速万能粉粹机；CP214万分之一天平。

1.2 试剂四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准品，纯度均≥95%（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；柠檬酸（分析纯，天津市风船化学试剂科学有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司）；乙二胺四乙酸二钠、三氟乙酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；0.1 mol/L柠檬酸溶液；0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液；Mcllvaine缓冲溶液（pH=4±0.05）；0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液；甲醇+水（1+19）；甲醇+乙酸乙酯（1+9）；10 mmol/L三氟乙酸水溶液。

2 方法

2.1 标准溶液的配制储备液：分别精密称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度为100 mg/L，置于-18℃保存。

混合标准中间液：分别精密吸取标准储备液各1 mL置于10 mL容量瓶中，用乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）溶解稀释至刻度，摇匀，即得混合标准中间溶液，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素浓度均为10 mg/L。

混合标准工作液：精密吸取0.125、0.25、0.5、0.75、1.25 mL混合标准中间液，分别用流动相溶液稀释定容至25 mL，即得系列混合标准工作液，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的浓度分别为50、100、200、300、500 μg/L。现用现配。

2.2 色谱分离条件 色谱柱：Incrtsil C8-5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：乙腈+10 mmol/L三氟乙酸水溶液=30+70；流速：1.0 mL/min；检测波长：350 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃。

2.3 样品的制备及处理

2.3.1 样品的提取 称取经捣碎匀浆的貉子肉样品5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL具塞离心管中，分别用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液冰水浴超声提取2次，每次涡旋混合1 min，超声提取10 min，3 000 r/min离心5 min（温度低于15℃），合并上清液，并定容至25 mL，混匀，5 000 r/min离心10 min（温度低于15℃），用快速滤纸过滤，待净化。

2.3.2 样品的净化准确吸取5 mL提取液以1滴/s的速度过HLB固相萃取住（使用前分别用5 mL甲醇和5 mL水预处理），待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水淋洗，弃去全部流出液，2.0 KPa以下减压抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脱，将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40℃），用1.0 mL流动相溶解残渣，过0.45 μm滤膜，待测定。

2.4 标准曲线的绘制配制系列浓度混合标准工作液,得到土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的浓度分别为50、100、200、300、500 μg/L，在上述色谱条件下测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，作校正曲线，得线性回归方程。

3 结果与分析

3.1 标准曲线及线性范围将系列标准工作溶液，依次从低浓度到高浓度进行分析，按峰面积与对应的对照溶液的浓度做标准曲线。其浓度在50～500 μg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归方程及相关系数见表1。

3.2 方法检出限按照上述2.3方法进行样品处理，标准品和样品依次在3.750 min（土霉素）、4.420 mi（n四环素）、6.953 min（金霉素）、7.848 min（强力霉素）出峰，空白试料对所测分析物无干扰，在该色谱条件下土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均得到很好的分离。根据样品进行标准物质添加回收率试验，以3倍信噪比可测得的最低质量浓度确定方法的检出限，土霉素为47.5 μg/kg、四环素为48.2μg/kg、金霉素为48.9 μg/kg、强力霉素为49.6 μg/kg；四环素类药物标准溶液色谱图见图1，空白组织的色谱图及空白组织中添加100 μg/kg四环素类药物的色谱图，见图2和图3。

表1 四环素类药物线性方程及相关系数Table 1Linear equations and correlation coefficients of tetracyclines

图1 四环素类药物标准溶液色谱图（50 μg/L）Fig.1Chromatogram of standard for tetracyclines

3.3 准确度和精密度采用标准添加法，在空白组织中添加3个不同浓度（50、100和200 μg/kg）的四环素类标准溶液进行回收率测定，每个浓度设定6个平行样品，同时进行空白试验，重复3次，四种药物回收率达到80.3%～97.4%，相对标准偏差（RSD）为1.9%～5.5%，结果见表2。准确吸取标准品溶液20 μL，重复进样11次，在相同色谱条件下对峰面积进行分析，结果表明，峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.31%，表明仪器精密度良好。

3.4 与 G B/ T 21317-2007方法比较

3.4.1 采用GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法——液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》方法中流动相：乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）时，结果见图4，由图4可见，阳性添加样品中四环素峰出现肩峰，峰分离度不佳。

3.4.2 采用GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法——液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》方法，回收率结果见表3，结果显示采用国标法对样品进行前处理，4种四环素类药物的添加回收率在70.2%～75.2%之间。

图2 空白样品色谱图Fig.2Chromatogram of blank sample

图3 加标样品色谱图（100 μg/kg）Fig.3 Chromatogram of positive sample

图4 加标样品色谱图（流动相：乙腈+三氟乙酸水溶液35+65）Fig.4 Chromatogram of positive sample

4 讨论

4.1 流动相比例的调整经比较，流动相乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）与乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70），后者作为流动相对目标峰的响应最灵敏、分离度好、出峰时间短，而且检测系统压力最低，考虑到在不影响分离度的前提下，最终选定乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）作为流动相，分离效果最理想。

表2 貉子肉中四环素类药物添加回收率试验结果Table 2Result of recovery test for tetracyclines in nyctereutes procyonoides tissues

表3 国标法测定貉子肉中四环素类药物添加回收率试验结果Table 3Result of national standard method for tretracyclines recovery rate in nyctereutes procyonoides tissues

4.2 样品提取过程的简化本文将GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》中样品前处理方法进行改进，在试样的提取过程中，分别用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液冰水浴超声提取2次，每次涡旋混合1 min，超声提取10 min，离心过滤后净化。该方法与GB/T 21317-2007进行比较，结果显示，采用国标法测定貉子肉中四环素类药物添加回收率试验中，土霉素添加回收率为70.2%～75.2%，四环素添加回收率70.2%～74.2%，金霉素添加回收率70.5%～73.7%，强力霉素添加回收率70.6%～74.8%；而采用改进后的样品前处理方法时，土霉素添加回收率为80.3%～97.4%，四环素添加回收率81.8%～96.8%，金霉素添加回收率80.4%～96.6%，强力霉素添加回收率80.7%～93.3%。从试验可以看出，采用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液冰水浴超声提取2次之后，貉子肉中四环素类药物的溶出量已趋于稳定，因此，按照前处理步骤越少越好、操作越简单越好、耗时耗材越少越佳的原则，选择该方法为最佳样品前处理方法。该方法简化了样品前处理步骤，且检测结果准确可靠，适用于高效液相色谱法测定貉子肉中四环素类药物残留。