壳寡糖对壳聚糖—明胶复合膜的牛肉保鲜性能影响

徐宏蕾， 王亚珍， 谢 晶， 李 立， 薛 斌， 邵则淮， 华欣怡， 孙 涛

（上海海洋大学 食品学院，上海201306）

牛肉在加工和储存的过程中，很容易受到微生物的污染，从而发生腐败变质。另外，牛肉中含的脂肪在自然光照和室温下可以发生自动氧化[1-2]，进而造成过氧化值升高，从而影响牛肉的风味以及营养价值。目前冷却肉的保鲜技术主要有冷冻保鲜、辐射保鲜、气调保鲜、高压保鲜、真空包装保鲜、化学防腐剂保鲜和涂膜保鲜等[3]，而大部分的化学防腐剂对人类健康都存在一定的危害，因此天然保鲜剂有着广泛的前景[4-5]。将天然保鲜剂加入包装膜中，可以进一步提高对食品的保鲜效果[6]。

壳聚糖具有良好的成膜性、阻隔性、生物相容性及可生物降解等特点。单一的壳聚糖膜力学性能较差，因此将明胶与壳聚糖共混制膜以改善壳聚糖膜的力学性能[7]。壳寡糖是壳聚糖降解后的产物，具有良好的抗氧化性能及抑菌活性，并且与壳聚糖具有相同的结构单元，两者具有良好的相容性。作者将壳聚糖、明胶及壳寡糖共混制得复合膜，研究了壳寡糖对壳聚糖—明胶复合膜性能的影响，以期制备一种具有良好保鲜效果的复合膜。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肉：购自上海市牛羊肉公司；壳聚糖（相对分子质量10万，脱乙酰度90%）：浙江金壳药业有限公司产品；明胶（食品级）：国药集团化学试剂有限公司产品；壳寡糖（相对分子质量1 000，脱乙酰度90%）：浙江金壳药业有限公司产品；绿茶多酚（儿茶素质量分数90.20%）：湖州荣凯植物提取有限公司提供；Nisin（乳酸链球菌素/乳酸链球菌肽）：浙江新银象生物工程有限公司提供；胰蛋白胨大豆肉汤：北京路桥技术有限公司产品；营养琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司产品；大肠杆菌（Escherichia coli）、 金色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）：上海海洋大学食品学院提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DCP-KZ300型电脑测控抗张试验机：四川长江造纸仪器有限责任公司产品；FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪：天津港东科技发展股份有限公司产品；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；KQ-600KDE型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；PYXDHS-40X50BS型隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂产品；SW-CJ-1F型净化工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；UV-2000型紫外分光光度计：上海龙尼柯仪器有限公司产品；AG8953电子分析天平：瑞士PRECISA公司产品；DELTA-320-S型pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品；FOSS Kjehec 2300全自动定氮仪：瑞士福斯公司产品。

1.3 壳聚糖基复合膜的制备

将壳聚糖—醋酸溶液与明胶溶液按体积比2∶1混合，加入体积分数1%甘油，分别加入质量分数20%的壳寡糖，磁力搅拌至完全溶解。静置消泡后，取75 mL膜液均匀铺展于干燥洁净的有机玻璃板（20 cm×30 cm）上，自然干燥后揭膜，保存于相对湿度（RH）为53%（用饱和硝酸镁溶液保持）的干燥器内备用。

1.4 膜的性能测定

1.4.1 厚度及透光率 用数显卡尺在待测膜的4个角以及中心位置取5点测其厚度，得到的平均值计为膜的厚度。选取光滑、平整、洁净且无瑕疵的膜，将待测膜剪成3 cm×1 cm大小，紧贴在比色皿（1 cm）的一侧，置于紫外可见分光光度计的样品池中，以空皿做空白对照，在700 nm波长处测其透光率，用透光率的大小间接表示膜的透明度。透光率越大，膜的透明度越好。

1.4.2 机械性能 膜的机械性能参照GB13022-91[8]。试验条件：拉伸速度为150 mm/min，夹具间距50 mm，测试环境温度为（23±1）℃，湿度为50%。每组膜测定6次。

1.4.3 水蒸气透过系数及水溶性 水蒸气透过系数的测定参照GB1037-70[9]。将膜裁成40 mm×40 mm的正方形，在干燥器中干燥至恒重后称重（m1），然后放入 300 mL蒸馏水中，于室温25℃下溶解12 h，再将膜在60℃的条件下干燥至恒重，称重（m2），根据膜质量变化计算水溶性。

水溶性（%）=（（m1－m2）/m1）×100%。

1.4.4 抑菌性能 复合膜的抑菌作用通过抑菌圈法测定[10]。无菌滤纸片为空白对照，实验结果取3个平行样品的平均值。

1.4.5 抗氧化性能 复合膜抗氧化性能的测定参照文献[11]。

1.4.6 数据处理 试验最少重复3次，所有数据用SPSS17.0软件处理，得到的结果表示为平均值±标准误差，并使用Origin8.5软件进行作图。

1.5 牛肉的保鲜研究

1.5.1 样品处理 所用刀具和案板用体积分数75%的乙醇溶液棉球擦拭并在紫外灯下照射30 min进行杀菌消毒。新鲜牛肉在无菌环境下进行操作，去除筋膜及多余脂肪，切成150 g左右大小均匀的肉块，随机分组，装于聚苯乙烯塑料托盘内，表面分别用壳聚糖/明胶复合膜、壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜包裹，以未经任何包装的样品作为空白对照。将所有样品贮存在（4±1） ℃的冰箱中，分别在 0、2、4、6、8、10、12、14 d 进行各理化指标和微生物指标的测定。每个样品每次实验均重复进行3次，结果取平均值。

1.5.2 pH值的测定 参照 GB/9695.5-2008[12]。将牛肉样品的包装打开后，立即称取5.00 g肉样，剁碎后加入45 mL蒸馏水于烧杯中，均匀搅拌后静置30 min，然后进行过滤，用精密数显pH计测定各样品滤液的pH值[13]。

1.5.3 挥发性盐基氮的测定 参照GB/T5009.44-2003。应用半微量凯氏定氮的原理，采用Kiehec2300型全自动定氮仪测定各样品储存期间挥发性盐基氮的含量[14]。

1.5.4 硫代巴比妥酸值（TBARS值）的测定 将样品牛肉切碎，准确称取5.00 g置于洁净的烧杯中，加入20 mL体积分数5%三氯乙酸溶液和4 mL质量分数0.15%BHT溶液，混合后置于离心管中，10 000 r/min，4℃条件下均质1 min后进行5 min高速离心，取上清液于50 mL容量瓶中，用体积分数5%三氯乙酸溶液定容。取2 mL溶液，加入2 mL 20 mmol/L硫代巴比妥酸溶液，（94±1）℃条件下水浴35 min，冷却后用紫外分光光度计在波长532 nm处测定其吸光值。采用2 mL蒸馏水与2 mL硫代巴比妥酸溶液的混合液按上述步骤测定作为空白对照。TBA质量分数以1 kg样品牛肉中含有的丙二醛的毫克数表示[15]。

1.5.5 菌落总数的测定 参照GB478 9.2-2010[16]。具体方法如下：将准确称取5.00 g样品，加入45 mL生理盐水进行均质，制成样品匀液，然后依次进行10倍梯度稀释。根据样品的腐败程度，选择适宜的稀释倍数。吸取100 μL适宜浓度的稀释液加入到营养琼脂培养皿上，用无菌涂布棒涂布均匀。然后将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养48 h后，观察记录平板上的菌落数，结果以菌落总数的对数值 lg（CFU/g）表示。

1.5.6 感官评价 参照参考文献。每次取1份样品，由5人组成感官评定小组进行品评，最终结果按“多数原则”确定。评分标准采用4段评分法，评分标准如表1所示[17]。

表1 感官评定标准Table 1 Sensory scoring criteria

2 结果与讨论

2.1 物理性能

表2给出了壳聚糖—明胶复合膜（A）、壳聚糖-明胶-壳寡糖复合膜（B）的部分性能参数。从表中可以看出，添加壳寡糖后，复合膜的厚度增大、透光率降低、抗拉伸性能有所提升，断裂伸长率下降，壳聚糖和明胶具有良好的成膜性，而不易成膜的壳寡糖会导致复合膜变脆，使膜的断裂伸长率下降[12]。壳寡糖的加入使得复合膜的水蒸气透过系数和水溶性上升，这可能是由于壳寡糖分子内部含有较多亲水基团导致。

2.2 抗氧化性和抑菌性

抗氧化性和抑菌性是食品保鲜膜的重要性能之一，添加壳寡糖后复合膜的抗氧化及抑菌性能见表3。由表3可知，添加壳寡糖后，复合膜的抗氧化及抑菌性均有较大提升。DPPH自由基清除能力被认为是评价物质抗氧化能力的标准方法之一[18-19]。从表3中可知，未加壳寡糖的膜DPPH清除能力非常弱，加入壳寡糖后复合膜的DPPH自由基清除能力显著提高。从表3中可知，壳寡糖的加入提高了复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，可以期望壳聚糖—明胶—壳寡糖复合膜比壳聚糖/明胶复合膜具有更好的保鲜性能。

表2 壳聚糖基复合膜的物理性能参数Table 2 Physical properties of chtiosan-based composite films

2.3 对牛肉的保鲜性能

2.3.1 牛肉pH值的变化 pH值是反映牛肉品质的重要指标，它的变化直接影响着牛肉的颜色、嫩度、风味、保质期等。GB/T9695.5-2008《肉与肉制品pH值测定》给出的肉类等级评价标准为：一级鲜肉5.8～6.2，二级鲜肉 6.3～6.6，6.7以上为变质肉。 图 1为壳聚糖/明胶复合膜（A）及壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜（B）在贮存过程中pH值的变化，从图1可知，新鲜牛肉的初始pH值约为6.53，在0～4 d内，两组的pH值均出现下降的情况，且在第4 d都已达到最低点，这可能是由于包装后的牛肉在低温条件下继续排酸成熟，引起pH值的下降。第4 d之后，两组样品的pH值都开始回升。随着贮存期的延长，牛肉中的蛋白质在蛋白质分解酶及微生物的共同作用下开始分解，分解后产生了碱性物质[20]，这可能是造成牛肉pH值增大的原因。从图中可以看出，对照组即没有任何包装处理的牛肉pH值迅速上升，在第8天已达到二级鲜度的临界值。而经壳聚糖复合膜包装后的牛肉pH值上升较为缓慢，其中壳聚糖/明胶/壳寡糖包装的样品在第14天时仍处于二级鲜度范围内。

2.3.2 牛肉TVB-N值的变化 挥发性盐基氮（TVB-N）指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，是动物性食品新鲜程度的重要指标[21]。GB 2710-2003中给出的TVB-N鲜度评价标准为：一级鲜度≤15 mg/hg，二级鲜度≤20 mg/hg，变质肉＞20 mg/hg。图2为壳聚糖/明胶复合膜实验组（A）、壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜实验组（B）和空白对照组（C）贮存过程中牛肉的TVB-N值变化，在冷藏前4天，两组包装膜内牛肉样品的TVB-N值相差不大，并且在前8天实验组的TVB-N值均保持在一级鲜度的范围内。然而空白对照组在第6天时已经开始明显高于实验组，后期TVB-N值上升速度加快。在贮藏第14天，B组的TVB-N值为18.37 mg/hg，低于A组和对照组，仍维持在二级鲜度范围内，说明壳寡糖加入对牛肉在贮藏期间TVB-N值的上升具有一定的抑制作用。

图1 冷藏过程中牛肉的pH值变化Fig.1 pH values of beef during storage

图2 冷藏过程中牛肉的TVB-N值变化Fig.2 TVB-N values of beef during storage

2.3.3 牛肉TBARS值的变化 牛肉中含有较高含量的不饱和脂肪酸，很容易被氧化，氧化后的分解产物丙二醛（MAD）可以和硫代巴比妥酸（TBA）发生反应，得到的产物是一种稳定的红色复合物，可以采用紫外分光光度计对其含量进行检测，通过测定此复合物的含量可以评价肉类在储藏过程中的品质变化[22]。参考评价标准为：当TBARS处于0.202～0.664时为良质肉；大于1时为次质肉[23]。

如图3所示，冷藏期间采用不同包装膜包装牛肉的TBARS值的变化与TVB-N值的变化趋势相似，各实验组及对照组的TBARS值均随贮藏时间的延长而逐渐增大。从第4天开始，对照组的TBARS值迅速增大，贮藏第10天，TBARS值达到0.993 mg/kg，已接近变质肉。A组（壳聚糖/明胶复合膜实验组）在第14天时已属于变质肉，B组 （壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜实验组）在第 12天时，TBARS值开始超过良质肉的范围，且在贮藏期间，B组样品TBARS值始终低于A组。说明壳寡糖对贮藏期间被包装牛肉样品的TBARS值的上升有一定的抑制作用，起到了抗氧化的作用，达到了保鲜的效果。

图3 冷藏过程中牛肉的TBARS值变化Fig.3 TBARS values of beef during storage

2.3.4 牛肉菌落总数的变化 微生物数量的多少是评价食品卫生质量的重要依据，可以反映出食品的腐败情况。GB4789.2-2010中给出的根据活菌总数评价肉的新鲜度的标准为：新鲜肉为5.0×104cfu/g 以下， 次鲜肉为 5.0×104～5.0×106cfu/g，变质肉为5.0×106cfu/g以上。图4为壳聚糖/明胶复合膜实验组（A）、壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜实验组（B）和空白对照组（C）贮存过程中牛肉菌落总数变化。冷藏前4天，所有组样品的细菌总数均维持在一级鲜度的范围内，随后实验组及对照组的细菌总数随贮存时间的延长均呈现出显著上升的趋势（p＜0.05）。其中C组的细菌总数上升速率最快，贮存至第12天时细菌总数的对数值已达到5.96，接近腐败；第14天，A、B实验组的细菌总数的对数值接近6.0，尽管在1.2.5实验中壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制作用，但是壳寡糖的加入并未明显提高复合膜在牛肉保鲜中的抑菌性，这可能是由于除大肠杆菌及金黄色葡萄球菌外，生鲜肉中最常见的几种引起肉腐败变质的腐败菌还有假单胞菌、肠杆菌、乳酸菌及热杀索丝菌[24]。

图4 冷藏过程中牛肉的菌落总数对数值变化Fig.4 Viable bacterial count of beef during storage

2.3.5 感官评价 表4为壳聚糖/明胶复合膜实验组（A）、壳聚糖/明胶/壳寡糖复合膜实验组（B）和空白对照组（C）感官色泽评分随时间的变化图。从表中可见，各组的感官色泽评分均随着贮藏时间的延长而降低，各组感官色泽评分值之间无显著性差异（p＞0.05）。C组在实验第2天感官色泽开始劣变，A组（壳聚糖-明胶复合膜）和B组（壳聚糖-明胶-壳寡糖复合膜）的感官色泽劣变分别开始在第4天和第6天，相比于空白对照组分别延长了2 d和4 d；在实验第14天，C组感官色泽评分下降明显，达到1.41，A组评分高于C组，为2.47，而B组评分最高，为3.36。实验结果表明两种复合膜对牛肉颜色劣变均有延缓作用，且壳聚糖—明胶—壳寡糖复合膜效果优于壳聚糖—明胶复合膜。

表4 不同复合膜包装条件下感官颜色的变化Table 4 Changes of color in different conditions

3 结语

壳寡糖使壳聚糖—明胶复合膜的抗拉伸性能有所提升，但其他机械性能指标有所下降；壳寡糖使复合膜的抗氧化性、抑菌性均有较大提升；添加壳寡糖后，壳聚糖/明胶复合膜对牛肉的保鲜性能有较大提升，可将货架期延长6 d；两种复合膜对牛肉的感官色泽劣变均有延缓作用，且壳聚糖/明胶/壳 寡糖复合膜效果优于壳聚糖—明胶复合膜。