鲑鱼皮明胶的提取及胶原蛋白肽的制备

孔 惠， 邢晓平， 曹玉华*， 曹光群

（1.江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡214122；2.盐城工学院 化学与生物工程学院，江苏 盐城 224051）

胶原蛋白作为细胞外基质的重要组成部分，是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广的蛋白质[1-3]。明胶是以胶原蛋白为原料，通过不可逆转的热变性部分水解得到的一种可溶性蛋白质[4]，相对分子质量分布在几万至几百万之间，不能被人体直接吸收。胶原蛋白肽作为胶原蛋白或明胶的酶解产物，相对分子质量低于10 000，具有特殊的生理活性，尤其以小分子的胶原蛋白肽更易被人体吸收。

市面上的胶原蛋白产品多从猪和牛的皮、骨中提取[5]。近年来海洋生物胶原蛋白的开发受到广泛关注，深海鱼类胶原蛋白最易被人体吸收[6]。鱼类加工过程中产生大量废弃物，如鱼皮、鱼鳞和鳍，可成为新的胶原蛋白资源，既降低了生产成本，又减少了环境污染[7]。而鱼皮中胶原含量比其它部位高很多，最高可超过其蛋白质总量的80%[8-9]。近年来，平鳍旗鱼[10]、阿拉斯加鳕鱼[11]、海鳗[12]、红鳍东方鲀[13]等海洋鱼类的鱼皮相继被用来提取胶原蛋白。

鲑鱼被称为“水中至尊”，鱼皮中存在大量胶原蛋白，作者以鲑鱼皮为原料提取明胶，进一步采用木瓜蛋白酶酶解明胶制备低相对分子质量胶原蛋白肽，并通过单因素实验及正交试验对酶解工艺进行优化[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干鲑鱼皮：北海斯麦儿贸易有限公司产品；木瓜蛋白酶（酶活1.23×105U/g生化试剂）：上海蓝季科技发展有限公司产品；其余试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司产品。

Free-Zone型真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司产品；TU-1901型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司产品；高效液相色谱Agilent 1100：美国安捷伦公司产品；高效液相色谱Waters1525及紫外检测器 Waters2487：美国Waters公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼皮前处理 干鲑鱼皮切成0.4 cm×0.4 cm碎块，清洗，0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，水洗至中性，正己烷浸泡24 h，去离子水冲洗干净。

1.2.2 明胶的提取及纯化 参考文献[15]，稍作改动。取适量处理后的鲑鱼皮，加入6倍体积质量分数为0.2%的H2SO4以200 r/min的转速搅拌40 min，去离子水冲洗至中性，再加入6倍体积质量分数为1.0%的 柠檬酸同一转速搅拌40 min，去离子水冲洗至中性，最后加入10倍体积去离子水，45℃恒温水浴搅拌过夜，先用2层纱布过滤，再将滤液以6 000 r/min离心20 min。上层清液中加入NaCl盐析48 h，8 000 r/min离心15 min，沉淀溶于0.5 mol/L醋酸溶液中，0.1 mol/L醋酸溶液透析24 h，再用去离子水透析48 h，每12 h换一次透析液，真空冷冻干燥后得到纯度较高的鲑鱼皮明胶。

1.2.3 明胶质量分数的测定 根据GB/T 9695.23-2008[16]，采用分光光度法，通过测定样品中羟脯氨酸质量分数，将羟脯氨酸含量乘以系数11.1[17]，即得到原料鲑鱼皮中明胶的质量分数。

1.2.4 紫外光谱扫描 将明胶样品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配成1 mg/mL溶液，在190～400 nm波长范围内进行扫描。

1.2.5 氨基酸组成分析 称120 mg明胶，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，真空封管，110℃水解22 h，水解液定容，过滤，移取1 mL滤液放入真空干燥器内过夜干燥。加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶液，静置1 h后，10 000 r/min离心10 min，取0.4 mL上清液进行氨基酸组成分析。

1.2.6 木瓜蛋白酶水解明胶的单因素实验 酶解初始条件为底物浓质量分数8%，加酶量5%，温度55℃，pH 7.0，水解时间2.5 h。水解过程中采用pH-stat法测定酶解液的水解度[18]，通过加入已知浓度的NaOH溶液保持酶解液pH不变，记录碱消耗量，计算水解度（DH）[19]。

1.2.7 胶原蛋白肽制备的正交实验设计 在单因素实验结果的基础上，以水解度为指标，按照L9（34）正交实验表综合考虑蛋白酶最适pH、最适温度、加酶量以及底物质量分数对胶原蛋白水解度的影响，结果见表1。

表1 正交实验设计因素水平表Table1 Levelsand factorsoforthogonaldesigned experiments

1.2.8 相对分子质量分布 将上述制备的明胶和肽溶于超纯水中，得到质量浓度1 mg/mL的试液，过膜。分析仪器：Waters 1525；色谱柱 TSK-gel G2000SWXL，流动相：V（三氟乙酸）∶V（乙腈）∶（水）=0.1∶40∶60；流量：0.5 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。检测波长220 nm。

2 结果与讨论

2.1 明胶提取率及纯度分析

由分光光度法得到羟脯氨酸回归方程：

A=0.190 1C-0.011 8

式中：A为吸光值；C为羟脯氨酸质量分数；相关系数为R2=0.995 8，相关性良好。由此得到鲑鱼皮中羟脯氨酸质量分数为4.19%，乘以换算系数11.1，得到鲑鱼皮中明胶总质量分数为46.51%。粗提物得率为28.12%，明胶提取率为60.46%。粗明胶中羟脯氨酸质量分数为7.56%，由此得明胶质量分数为83.92%。

2.2 紫外光谱分析

蛋白质分子含有能够吸收某一波长光的紫外生色基团，各种紫外生色基团的加和使蛋白质分子有一定的紫外吸收[20]。由图1可见，得到的鲑鱼鱼皮提取液的紫外最大吸收峰在233 nm，符合明胶的紫外吸收特征，主要是肽键C=O电子n→π*和n→σ*跃迁产生的强吸收。鲍士宝等研究鮰鱼皮胶原蛋白的紫外最大吸收峰为233 nm[21]，与作者提取得到的明胶紫外最大吸收峰结果相似。而芳香族氨基酸色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）中含有共轭双键，其中Trp和Tyr在280 nm附近有紫外吸收，Phe在257 nm处有紫外吸收[22]，而Trp在280 nm处的紫外吸收最强，但明胶中几乎不含Trp，所以在280 nm处无强吸收峰。本实验中的明胶在250～280 nm处有极弱的紫外吸收峰，说明含有少量的Phe等芳香族氨基酸，与表2中氨基酸分析结果一致。因此，紫外吸收光谱表明经酸浸-水提法得到纯度较高的鲑鱼皮明胶。

图1 鲑鱼皮明胶紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of the gelatin from salmon skin

表2 鲑鱼皮明胶的常规氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of gelatin from salmon skin

2.3 氨基酸组分分析

明胶的氨基酸组成有其特点，甘氨酸约占氨基酸总质量的30%，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）含量较高，其中脯氨酸约占氨基酸总质量的10%，而羟脯氨酸作为明胶的特征氨基酸含量较高，并且明胶不含或含极少量的半胱氨酸和色氨酸，对于绝大多数的蛋白质而言，脯氨酸的质量分数相对较少，目前只有胶原蛋白的脯氨酸质量分数超过10%[23]。

表2中列出了鲑鱼皮明胶的氨基酸质量分数，甘氨酸质量分数最高，为34.4%，其次为丙氨酸和脯氨酸，质量分数分别为13.01%、11.57%，亚氨基酸总含量为16.67%，甘氨酸和亚氨基酸质量分数约占总氨基酸的50%。芳香族氨基酸及含硫氨基酸质量分数极少。因此，通过对表2中氨基酸组成的分析可知，实验得到的是纯度较高的鲑鱼皮明胶。宋芹等[24]研究罗非鱼皮胶原蛋白中甘氨酸质量分数最高，为32.28%，丙氨酸及脯氨酸质量分数分别为12.36%、11.74%，羟脯氨酸质量分数为8.17%，与鲑鱼皮明胶相比略有差异。

2.4 木瓜蛋白酶水解明胶的单因素实验

作者考察了酶解时间、底物质量分数、加酶量、pH、温度对木瓜蛋白酶水解鲑鱼皮明胶反应的影响。

由图2（a）可知，反应一开始，水解度随时间变化很快。1 h后，水解速度减慢，水解度变化也趋于平缓。2.5 h后，水解度几乎不随时间的变化而变化，水解反应及其缓慢，故水解时间选定为2.5 h。

由图2（b）可以看出，底物浓度与水解度呈正相关性，当底物质量分数为8%时达到最大值，当底物质量分数大于8%时，水解度呈下降趋势。这是因为，底物质量分数低会降低底物与酶分子结合机率，影响酶促反应的速率，底物浓度增大使得酶作用点增加，水解度增大。而继续增大底物质量分数，使得水解液过于黏稠，酶无法在水解液中完全扩散，酶解效率降低，水解度下降。所以底物质量分数选定为8%。

由图2（c）可以看出，加酶量增大，水解度随之增大，当加酶量为质量分数7%时，酶解速度开始变慢。因为酶具有专一性，只能打开相应位点上的肽键，当加酶量继续增加，所有肽键均被打开后，水解度基本不会再变化。所以加酶量选定为质量分数7%。

由图2（d）可知，pH作为酶解反应的主要因素，水解度随着pH值的增大而增大，当pH为8.0时水解度最大，继续增大pH，水解度呈现下降的趋势。主要是因为pH过高或过低都可能使酶分子变性。另外，在酶解反应过程中，酶解液pH的变化会影响酶的活性部位及其附近的解离基团与底物的结合，同时底物的解离也受pH变化的影响，因此确定适宜pH值为8.0。

温度是影响酶解反应的主要因素。由图2（e）可知，温度与水解度也呈正相关性，水解温度达到55℃时，水解度最大，此后继续升高温度，水解度开始降低。这是因为低温使酶与底物的碰撞机率降低，高温使酶失去活性。所以水解温度选定为55℃。

由单因素实验得到木瓜蛋白酶水解鲑鱼皮胶原蛋白的最优条件为：酶解时间2.5 h、底物质量分数 8%、酶质量分数 7%（8 610 U/g）、pH 8.0、温度55℃，该条件下水解度为12.27%。

2.5 正交试验结果与分析

由表3分析可知，各因素对木瓜蛋白酶水解明胶制备胶原蛋白肽水解率的影响次序为 A＞C＞D＞B，即加酶量＞酶解温度＞pH＞底物质量分数。通过极差分析得到最优水平为A2B3C3D3，即酶解时间2.5 h，加酶量7%，底物质量分数 10%，酶解温度60℃，pH8.5。而根据水解度数据分析得到较优的组合为A2B3C2D2。以上2种水平组合分别进行3次平行实验，平均水解度分别为12.53%和12.65%。水解度较高的是A2B3C2D2，即酶解时间2.5 h，加酶量7%，底物质量分数10%，酶解温度55℃，pH 8.0。

图2 木瓜蛋白酶水解鲑鱼皮明胶的单因素实验Fig.2 Optimization of reaction conditions of enzyme hydrolysis of gelatin from salmon skin

表3 鲑鱼皮明胶酶解反应正交实验分析Table 3 Orthogonalarray experimentalresults of enzymatic hydrolysis reaction of gelatin from salmon skin

2.6 鱼皮胶原蛋白肽相对分子质量分布

图3和表4反映了酸浸-水提法提取的鲑鱼皮明胶相对分子质量情况，相对分子质量大于10 000的占96.7%，主要集中在25 000，还有少部分成为游离氨基酸。图4和表5反映了木瓜蛋白酶水解鲑鱼皮明胶得到的胶原蛋白肽的相对分子质量分布情况，相对分子质量在3 000以下的占99.73%，并且主要集中在1 000以下，约占91.5%。

图3 鲑鱼皮明胶相对分子质量分布图Fig.3 Molecular weight distribution profile of gelatins from salmon skin

图4 鲑鱼皮胶原蛋白肽相对分子质量分布图Fig.4 Molecular weight distribution profile of collagen peptides from salmon skin

表4 鲑鱼皮明胶的相对分子质量分布Table 4 Molecular range of gelatin from salmon skin

3 结语

以鲑鱼皮为原料通过酸浸-热水抽提法提取得到明胶，提取率为60.46%，明胶纯度为83.92%。经紫外光谱扫描确定最大吸收波长为233 nm，并通过氨基酸分析进一步确定提取物为纯度较高的明胶，符合明胶的理化特征。选用木瓜蛋白酶对明胶进行水解，并通过单因素实验及正交实验优化实验条件，确定最优酶解条件为：水解时间2.5 h，加酶量7%，底物质量分数10%，酶解温度55℃，pH8.0，该条件下水解度为12.65%。制备的胶原蛋白肽相对分子质量主要集中在1 000以下，占到91.5%，属小相对分子质量胶原蛋白肽。