γ-CGTase突变体制备及其产γ-CD条件优化

王金鹏 ， 王 萍 ， 苑 征 ， 李林林 ， 范浩然 ， 金征宇

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；3.食品安全与营养协同创新中心，江南大学，江苏 无锡214122）

环糊精（cyclodextrin，简称CD）是由环糊精葡萄糖基转移酶 （cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase）酶解淀粉或者淀粉类似物产生的由D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键连接而成的一类环状低聚化合物[1-3]。与α-CD、β-CD相比，γ-CD具有独特的性质：首先，γ-CD具有较大的空腔和较高的溶解度，能够包埋较大的客体分子从而增加其溶解度，进而改变它们的理化性质；其次，γ-CD安全性高，可以被人体内的唾液淀粉酶和胰异淀粉酶迅速消化[4-5]，因此，γ-CD在人体小肠内可以迅速的降解和吸收[6-7]，但α-CD、β-CD则不能。并且γ-CD的高生物利用度使得其在食品和医药领域有着特殊的应用。

影响γ-CD产率及产物专一性的因素有很多，主要包括CGTase的来源及其酶学特性，反应条件如反应时间、反应温度、底物浓度、底物种类、有机溶剂种类及含量等的影响。曹新志等[8]以质量分数5%的马铃薯、玉米、木薯、甘薯、焦藕淀粉为底物，加入质量分数2%的甘草酸和适量的CGTase酶液，于60℃反应12 h，结果表明以木薯淀粉和焦藕淀粉为底物时γ-CD转化率最高；Rendleman等人[9]利用Bacillus sp.AL6生产γ-CD时，当底物质量分数由2.5%增加到6%时，γ-CD的转化率却由35%降到了21%。Kyoko等人[10]研究发现改变反应的pH，也会使环糊精种类所占比例发生改变。还有研究表明，在低温及有机溶剂存在的条件下，更有利于提高环糊精的转化率，因为低温条件下环糊精-有机溶剂复合物更加稳定，易于将环糊精从反应体系中沉淀出来，使酶反应向着正方向进行[11-12]。

作者所用γ-CGTase来自于Bacillussp.G-825-6，据报道该酶催化淀粉不产生α-CD，仅产生β-CD和γ-CD。作者依据参考文献，对该酶位于-7亚位点附近的211位氨基酸（酪氨酸）进行了定点突变，研究了突变体Y211L催化淀粉产γ-CD的条件，对于降低γ-CD的生产成本和推动γ-CD的工业化生产具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒 pET-20b （+）/γ-cgt： 德国莱比锡大学Zimmermann教授提供；克隆宿主E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）：购于南京百斯凯科技有限公司。

可溶性淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、氨苄、三羟甲基氨基甲烷等：购自国药集团。

高速冷冻离心机（BIOFUGE PRIMOR）：美国Thermo Scientific有限公司产品；双光束紫外可见分光光度计（TU-1900）：北京普析通用仪器有限责任公司产品；高效液相色谱仪（LC-20AT230V）、示差折光检测器 （RID-10A）、AKTA purifier900蛋白纯化系统：岛津公司产品；Hypersil NH2色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 mAPS-2Hypersil 微 粒 ）： 美 国Thermo公司产品；纯泰Ni-NTA亲和层析柱：GE Healthcare life sciences公司产品；ShodexOHpak SB-804 HQ和OHpak SB-802.5 HQ色谱柱：日本昭和公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 突变体的构建 以质粒 pET-20b（+）/cgt为模板，设计一对互补引物，采用一步PCR法突变CGTase基因中的相应位点，设计引物如下：

正向引物：5’-ATC GAAATCTTCTTGATTTAG CTAGT-3’，

反 向 引 物 ：5’ -GACTAGCTAAATCAAGAA GAT TTC GAT-3’，

PCR反应体系为：DNA模板10～100 ng，正向突变引物（10 μmol/L）1 μL，反向突变引物（10 μmol/L）1 μL，5×Reaction Buffer10 μL，Fast Alteration DNA Polymerase（2.5 U/μL）1.5 μL，用灭菌的双蒸水补充至 50 μL。

质粒DNA的提取按照Thermo Scientific公司的质粒小提试剂盒说明书提取。

PCR扩增条件为：预变性（95℃）3 min；变性（95 ℃）30 s，退火（55 ℃）30 s，延伸（72 ℃）3 min，共30个循环；延伸（72℃）5 min，冷却至 4℃。

取PCR产物50 μL加入20 U/μL的限制性内切酶DpnI 1 μL，充分混匀后将该酶切体系于37℃条件下消化1 h。

将酶切后的产物转化至宿主菌中，具体步骤如下：从-80℃冰箱中取出感受态细胞E.coli DH-5α置于冰上解冻；取45 μL刚刚解冻好的感受态细胞和5 μL DpnI消化产物放于提前预冷好的2 mL无菌离心管中，用枪头轻柔吹打混匀，继续冰浴30 min；将试管放到42℃水浴锅中，准确热激60 s，立即置于冰上5 min；加入500 μL预热的无菌的LB培养基（不含Amp），混匀后置于37℃摇床以200 r/min振荡培养1.5 h，使菌体复苏；培养结束后，5 000 r/min离心5 min，去掉上清液400 μL。将余下的感受态细胞涂布在含有Amp的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12～16 h。

挑取LB平板上的单菌落接种至含有100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中以200 r/min振荡培养10 h，然后提取质粒、酶切，DNA琼脂糖凝胶电泳验证，将验证正确的质粒送至上海生物工程公司测序鉴定。将测序正确的质粒转化至E.coli BL21（DE3），挑取单菌落接种至含有 100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中以200 r/min振荡培养过夜，保藏菌种即得到含有突变质粒的基因工程菌，将该基因工程菌置于-80℃冰箱中保藏。

1.2.2 Y211L/γ-CGTase 的制备、纯化

1）溶液配制方法 LB培养基配制：取胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g，加入去离子水1 L，搅拌均匀后分装，于高压灭菌锅内121℃灭菌15 min；IPTG溶液制备：准确称取1.19 g异丙基-β-D-硫代半乳糖苷置于10 mL烧杯中，加入少量无菌水溶解后，转移至灭菌的5 mL容量瓶中定容，分装后于-18℃下保存；氨苄溶液配制：准确称取1 g氨苄置于10 mL烧杯中，加入少量无菌水溶解后，转移至灭菌的10 mL容量瓶中定容，分装后于-18℃下保存；Tris-HCl溶液配制：取6.05 g三羟甲基氨基甲烷置于1 L的烧杯中，加入1 L去离子水溶解，滴加盐酸用pH计调pH至0.85，后置于4℃冰箱保存。

2）环糊精糖基转移酶的制备方法 从冰箱中取出甘油管保藏菌接种至含有50 mL LB培养基的250 mL的锥形瓶中，在37℃、200 r/min条件下振荡培养10 h。

按体积分数4%的接种量接种至含有100 mL培养基的500 mL的锥形瓶中培养，在600 nm下测定吸光度，待A600nm=0.6～0.8时加入IPTG使其终浓度为0.05 mmol/L，后在18℃、200 r/min下诱导培养16 h。培养结束后，菌液在5 000 r/min离心30 min，弃掉上清液，收集菌体。将菌体悬浮于pH 8.5的Tris-HCl中进行超声破碎，离心后所得上清液即粗酶液。

3）环糊精糖基转移酶的纯化方法 粗酶液纯化采用淀粉吸附法。向粗酶液中按质量分数5%加入玉米淀粉，然后加入硫酸铵使其终浓度为1 mol/L，在4℃下缓慢搅拌1 h，使酶充分被淀粉吸附；反应结束后将混合物5 000 r/min离心15 min，沉淀用预冷的1 mol/L的硫酸铵洗涤除去未被吸附的蛋白质，离心后取沉淀；将沉淀用含有1 mmol/L γ-CD的50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl在37℃下振荡混合30 min离心后得到洗脱液1，将剩余沉淀再用同样的含有γ-CD的缓冲液洗脱，得到洗脱液2；将两次洗脱液合并，用50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液在4℃透析24 h，每隔8 h换一次缓冲溶液。

1.2.3 γ-CD标准曲线测定方法 称取0.4 g γ-CD，用少量超纯水溶解后定容至100 mL，配制成4 mg/mL的标准溶液。取标准溶液分别稀释至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL，取适量稀释液过膜用高效液相色谱法测定绘制标准曲线，测定条件为流动相体积分数70%乙腈，流量1 mL/min，温度40℃，进样量 20 μL。

1.2.4 酶活测定 配制质量分数2%的可溶性淀粉为底物，取900 μL底物于2 mL离心管中加入100 μL酶液，置于酶反应器上反应50℃，800 r/min反应半小时后取500 μL沸水浴中灭活10 min，测定。剩余的500 μL继续反应半小时后煮沸灭活，测定。

测定方法：以γ-CD的转化率为指标采用高效液相色谱法进行分析。取反应液500 μL加入500 μL乙腈10 000 r/min离心10 min取上清液过膜，进行测定分析，分析条件为流动相体积分数70%乙腈，流量 1 mL/min，温度 40 ℃，进样量 20 μL。

酶活定义：上述方法，每30 min生成1 mmol的γ-CD需要的酶量为一个酶活单位。

1.2.5 催化条件优化方法

1）单因素实验 以γ-CD的转化率为指标分别考察底物种类、底物浓度、加酶量、反应时间对CGTase催化淀粉分解的影响。

分别取玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉做为底物，加入去离子水加热糊化，制成质量分数为1%的溶液，冷却到室温，取1 mL底物加入适量CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24 h，结束后沸水浴灭酶10 min。取500 μL反应液加入500 μL乙腈10 000 r/min离心10 min后过膜，采用HPLC对γ-CD含量进行测定。测定方法与2.3.2中相同。

取最适底物，分别配制质量分数为1%、3%、5%、7%的溶液，加热糊化后冷却到室温，取1 mL底物加入适量CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24 h，结束后沸水浴灭酶10 min，取500 μL反应液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min离心 10 min后过膜，采用HPLC对γ-CD含量进行测定。测定方法与2.3.3中相同。

选取最佳底物配制成最佳质量分数的溶液，加热糊化后冷却到室温，取1 mL底物分别加入2、4、6、8、10 U/g的CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24 h，结束后沸水浴灭酶10 min，取500 μL反应液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min离心 10 min后过膜，采用HPLC对γ-CD含量进行测定，测定方法与2.3.3中相同。

2）正交设计实验 在单因素实验的基础上选取底物质量分数、加酶量、反应时间3个因素，进行正交实验，选用正交表L9（33）对CGTase的催化淀粉分解条件进行优化，实验结果采用Minitab16软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 突变体的验证

用DNAman对目的基因碱基序列和突变后的碱基序列进行比对，发现目的基因中的酪氨酸Y（TAT）成功突变成了亮氨酸 L（CTT），结果见图 1。

图1 突变前后基因的碱基序列比对图Fig.1 Base sequence alignment for the gene before and after mutation

2.2 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉条件探索

2.2.1 底物种类对催化反应的影响 由图2可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉的反应中，不同的反应底物对γ-CD的得率影响较大。其中木薯淀粉为底物时γ-CD的得率最高，马铃薯淀粉和可溶性淀粉为底物时γ-CD的得率较小。推测其原因是，不同来源的淀粉其直链淀粉/支链淀粉的比例不同，且分子量大小存在很大差异，这将影响γ-CGTase（Y211L）催化作用，进而造成不同的环糊精产率。

2.2.2 底物质量分数对催化反应的影响 由图3可知，随着底物质量分数的增加，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉产生γ-CD的质量浓度先增加后减少，质量分数为5%时γ-CD的质量浓度达到最大，推测原因可能是由于低浓度时，酶催化反应较彻底，体系中小分子浓度较高，加剧了CGTase的偶合和环化作用，造成了较低的环糊精含量，随着底物质量分数的升高，反应向环化方向偏移，但底物质量分数过高时，造成两个或两个以上的底物分子占据酶蛋白的活性位点，这可能会形成无活性的中间产物，使酶活性受到抑制。而且，底物质量分数过高，体系黏度较大，底物流动性减小，使酶无法与底物充分接触，减弱 γ-CGTase（Y211L）的环化作用。

图3 底物质量分数对催化反应的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on catalysis

2.2.3 加酶量对催化反应的影响 如图4可知，CGTase催化淀粉反应随加酶量的增加γ-CD的产量先增加后减少，在4 U/g时γ-CD的产量最大，因此加酶量选取4 U/g。

γ-CD产量随加酶量先增加后减少，可能是由于加酶量过少时，反应缓慢；加酶量过高时，酶催化反应较彻底，环糊精降解，体系中小分子浓度较高。

图4 加酶量对催化反应的影响Fig.4 Effect of enzyme concentration on catalysis

2.2.4 反应时间对催化反应的影响 如图5可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉反应随反应时间的增加γ-CD的产量不断增加，在24 h之前增加较快，24 h之后增加缓慢。出现这种现象可能是由于，在反应开始阶段，体系中长链底物较多，利于环化反应进行，因此γ-CD的产量增加较快。但随着反应时间的延长，体系中产物不断增加，竞争性产物抑制作用加强，环化反应活性降低；同时，可能由于小分子浓度的增加，促进了CGTase的偶合和歧化作用，因而导致反应速率下降。

图5 反应时间对催化反应的影响Fig.5 Effect of time on catalysis

2.3 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉条件优化

以单因素探索的底物质量分数、加酶量、反应时间这3个因素对γ-CD产率的影响为依据，进行3因素、3水平的正交实验设计，因素水平表如表1所示，正交实验结果如表2所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

由表2可知，CGTase催化淀粉分解的最佳参数为A3B1C1，因素对试验结果的影响顺序为A＞B＞C，所以CGTase催化淀粉分解的最佳条件为：反应底物木薯淀粉，质量分数6%，加酶量4 U/g，反应时间24 h，反应温度50℃。

表2 正交结果和分析Table 2 Results and analysis of orthogonal

2.4 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉产物的分析

在同样的催化条件下，原始的γ-CGTase催化淀粉后产物的HPAEC测定图如图6（a）所示，突变体Y211L的催化产物图如图6（b）所示，由图可以看出，突变体Y211L催化生成的环糊精中γ-CD明显提高，表明突变体具有良好的催化专一性，该研究能为γ-CD的工业化生产提供参考。

3 结 语

γ-CGTase（Y211L）是一种多功能酶，它能够通过环化反应催化淀粉转化为环糊精。目前对于CGTase催化淀粉产物的研究主要集中于产α-CD、β-CD，对γ-CD的研究较少。但是γ-CD具有较高的溶解性，同时其空腔也较大，具有较好的应用前景。作者构建了γ-CGTase突变体Y211L，从单因素实验、正交实验进行了制备γ-CD的条件优化，在适当的反应条件下提高了γ-CD的产量，对以后γ-CD产量的提高及其应用具有一定参考价值。