复合酶处理废弃烟末制备烟用美拉德香精

游 霞， 刘彩红， 崔步云， 李雅琪， 韦凤杰， 吴鸣建*

（1.郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州 450001；2.河南烟草公司，河南 郑州 450002）

关键字：烟草废弃物；淀粉酶；美拉德反应；GC-MS分析

中国烟草的种植面积和产量均居世界前列，但其中20%～30%烟叶是不能用作卷烟原料的，这不仅浪费资源，还污染环境，因此合理综合利用烟草废弃物变得尤为重要[1]。

美拉德反应又称为非酶棕色化反应，主要是氨基化合物与羰基化合物之间的复杂反应，美拉德反应会产生很多致香物质，其中大部分也是烟草中重要的香味成分。目前对烟草废弃物的综合利用主要是从中提取茄尼醇、烟碱、蛋白质、果胶、烟酰胺和黄酮类等物质，但附加值较低。烟草中水溶性糖中还原糖的质量分数可达25%，非还原糖可达5%；不溶性的多糖中淀粉和果胶的质量分数可达8%，在酶的作用下水解为单糖，即能为美拉德反应提供足够的碳源[2-10]。

利用美拉德反应制备的烟用香精，因其具有天然、健康和安全的特性而倍受青睐[11]，大部分研究主要集中在以单糖和氨基酸为原料来来研究美拉德反应[12]，而以烟草废弃物为原料的研究较少。作者是以烟草废弃物为原料来制备美拉德烟用香精，作者以α-淀粉酶和β-淀粉酶的复合酶处理烟草废弃物，以复合酶解液为主要碳源，外加氨基酸为氮源，通过美拉德反应制备烟用香精；采用GC-MS分析美拉德反应产物的化学成分，并评价其感官效果，以期为烟用香精的制备和烟草废弃物的利用化提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

烟草废弃物：由河南省平顶山烟叶示范田提供，50℃烘干，粉碎，过80目筛；α-淀粉酶和β-淀粉酶：南宁庞博生物工程有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

FW-400A倾斜式高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司产品；98-3数显磁力搅拌器：郑州凯鹏实验仪器有限公司产品；752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品；Agilent7890A/5975C气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 美拉德反应基液的制备 将废弃烟末置于圆底烧瓶中，按照一定料液质量体积比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，加入α-淀粉酶和β-淀粉酶，调节pH，在适当的温度下电动搅拌反应一段时间。在5000r/min下离心30min，取上清液，旋蒸浓缩。

1.2.2 美拉德反应 在装有温度计、回流冷凝管的烧瓶中依次加入美拉德反应基液、丙二醇与水的混合溶剂60 mL，用质量分数10%NaOH或6 mol/LHCl调节pH，在115℃下，反应5 h，反应结束后，在冰水浴中冷却。

1.2.3 还原糖和水溶性总糖的测定 还原糖：参考文献[5]提供的方法；水溶性总糖：DNS比色法。

1.2.4 美拉德反应产物质量评定

1）褐变程度的测定 取1 mL美拉德反应产物使其溶于10 mL的蒸馏水中，参比为蒸馏水，在752N型紫外分光光度计下测定420 nm下的吸光值，吸光值越大，其颜色强度就越大，说明美拉德反应越充分，得到的反应物色泽越好[6]。

2）风味评价 把制备的Maillard反应产物样品装入喷雾器中，喷雾器喷洒到低档次的烟丝上，其中确保喷物量为烟丝质量的1.5‰，把喷洒过的烟丝经过相应处理后，由评吸小组进行感官评吸[8]，对其香气、光泽、协调性、刺激性、余味、杂气6项指标进行评吸打分，评分标准如表1。

1.2.5 GC-MS分析条件

1）美拉德反应产物醚溶性成分的分离 取30 mL美拉德反应的产物，加15 g NaCl使其饱和，再分别加入40、40、20 mL乙醚，依次萃取，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，在旋转蒸发仪中浓缩至1mL，进行气质联用仪器分析[7]。

2）色谱检测条件 色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 程序升温：60 ℃保持 3 min，以5℃/min的速度升至250℃，并保持20 min；进样温度：250 ℃；载气：纯 He，载气流量：1 mL/min；分流比 10∶1；进样量为 1 μL。

表1 各单项指标评分标准Table 1 Score standard about each single index

3）质谱检测条件 离子源温度：230℃；质量扫描范围为35～500；离子源电子能量：60 eV。MS谱图：NIST质谱数据图进行检索。

2 结果与讨论

2.1 单一酶酶解对还原糖质量体积浓度的影响

由图1可看出，酶解液上清液中还原糖的质量浓度随着酶用量的增加而增加，最后趋于平衡。α-淀粉酶质量分数在0～0.1%之间时，还原糖的质量浓度随着α-淀粉酶质量分数的增加而快速增加，在0.1%～0.2%之间时，α-淀粉酶质量分数增加速率明显没有在0～0.1%的快，当α-淀粉酶质量分数为0.2%时，还原糖质量浓度达到最大值，再继续增加α-淀粉酶用量对还原糖质量浓度几乎没有变化，因此α-淀粉酶用量的最适区间为0.1%～0.2%。

图1 α-淀粉酶和β-淀粉酶质量分数对还原糖质量浓度的影响Fig.1 Influence of α-Amylase and β-Amylase content on the quality volume concentration of reducing sugar

β-淀粉酶质量分数在0～2.0%时，还原糖的质量浓度随着β-淀粉酶质量分数的增加而剧烈增加，当β-淀粉酶质量分数在2.0%～3.5%时，还原糖质量浓度虽随着β-淀粉酶质量分数增加而增加，但增加幅度明显没有在0～2%之间变化的大，仍有增长的趋势。因此，选择β-淀粉酶的最适质量分数变化范围为2%～3%。

2.2 复合酶配比组合的筛选

由图2可看出，当双酶复配时，会表现出不同于两种酶的活性，可促进反应，也可抑制反应。整体还原糖的质量体积浓度先随着复合酶用量的增加而增加，增加到最大值，接着还原糖的质量体积浓度随复合酶用量增加又降低。当α-淀粉酶用量变化时，总体变化趋势是一致的，当β-淀粉酶质量分数在2%～3%时，会发现两条曲线几乎是重合的，还原糖的质量浓度成上升趋势，说明在这区间，α-淀粉酶的用量对还原糖的质量浓度影响很小；当β-淀粉酶质量分数在3%～4%时，两条曲线完全分开，此时还原糖的质量浓度呈下降趋势，α-淀粉酶质量分数为在0.2%时，还原糖的质量浓度相对高点。综合可得双酶复配组合最佳为：质量分数0.2%α-淀粉酶+3%β-淀粉酶。

图2 复合酶质量分数对还原糖质量浓度的影响Fig.2 Influence of compound enzyme content on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3 复合酶酶解单因素实验分析

将质量分数0.2%α-淀粉酶和3%β-淀粉酶对废弃烟末进行酶解，分别考察酶解时间、酶解温度和酶解pH对酶解的影响。

2.3.1 酶解温度对复合酶酶解废弃烟末效果的影响 由图3可见，酶解液上清液中还原糖质量浓度是先增加至最大值后降低的趋势。在温度由30℃开始升高时，热运动加快，使酶的反应速度加快，温度至50℃时，这时还原糖的质量浓度达到最大值，继续增加温度，酶的反应速度会快速降低，此时温度过高会使酶蛋白的结构发生变化，导致蛋白酶部分失活，因此复合酶的最适温度为50℃。

图3 温度对还原糖质量浓度的影响Fig.3 Influence of compound enzyme content on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3.2 酶解时间对复合酶酶解废弃烟末的影响由图4可以看出，还原糖的质量浓度总体变化趋势是：先增加最后趋于平衡的。在1～7 h内，说明溶液中有足够的多糖与酶结合，使还原糖质量浓度增加，速度也比较快，随着反应的进行，多糖逐渐消耗，与酶结合量减少，当反应进行到7 h时，还原糖的质量浓度到达最大值，之后缓慢变化，趋于平衡。因此，时间的最佳选择为7 h。

图4 时间对还原糖质量体积浓度的影响Fig.4 Influence of reaction time on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3.3 酶解pH对复合酶酶解废弃烟末效果的影响由图5可看出，还原糖的质量浓度变化的整体趋势是：随着pH值的增加先增加后降低的。随着pH的增加，酶活性随pH的增加而变大，当pH值增加到5.4时，还原糖的质量浓度达到最大值25.46 mg/mL，此时酶的反应速率也是最快的，随着pH的继续增加，酶催化活性受到抑制，反应速率降低，还原糖的质量体积浓度也有所降低。因此，复合酶的最适pH值为5.4。

图5 pH对还原糖质量浓度的影响Fig.5 Influence of pH on the quality volume concentration of reducing sugar

2.4 美拉德反应工艺的优化

2.4.1 氨基酸种类的确定 根据酶解液中还原糖的质量体积浓度计算出浓缩液中还原糖的质量，采用氨基酸与糖类的摩尔比为1∶1进行美拉德反应。各取3 g的L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-苯丙氨酸分别与 6.06、3.67、4.46、2.25、3.25 g的复合酶酶解的浓缩液加入圆底烧瓶中，再加入51 mL的1，2-丙二醇与9 mL的蒸馏水，用质量分数10%NaOH或6 mol/L HCl调节pH 7，反应温度为100℃，在磁力搅拌器中回流5 h。经过相应的处理，测定美拉德反应产物的颜色强度和评吸得分，结果见图6。

图6 氨基酸的种类对美拉德反应的影响Fig.6 Effect of the kind of amino acid on Maillard reaction

氨基酸种类的不同，会使美拉德反应速率不同，其美拉德反应产物的组成与香气特征也不同，由图6可知，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸的颜色强度分别为：1.521、1.6、1.41、1.223、1.295，L-丙氨酸数值最高， 说明其反应比其他氨基酸反应充分。评吸得分分别为83、81、75、60、51，虽然 L-谷氨酸评吸得分最高，但其反应程度没有L-丙氨酸大，因此选择氨基酸为L-丙氨酸。

2.4.2 正交试验优化美拉德反应的工艺 试验中，根据含水量、反应时间、反应温度和pH值等因素的影响，设计正交试验（如表2）在不同条件下合成了一系列新型香料。通过感官评吸和褐变程度，确定试验的最佳条件。

表 2 3 水平 4 因素 L9（34）正交表Table 2 Orthogonal table for L9（34）

由表2的数据可知：pH值、温度、时间、反应系含水率对颜色强度的影响大小。极差的值表现出因素对颜色强度的影响情况，极差值越大，说明对颜色强度的影响越深。右表2可知，4个因素的极差值由大到小分别为：R时间＞R温度＞R反应系含水率＞RpH值。 可知时间对美拉德反应影响最深，其次，温度，影响最小的则为pH值。

按均值选取最佳水平。通过比较每个因素的3个均值大小，选择均值最大的为最佳水平，最佳水平为A3B3C3D2。也就是，美拉德反应的最佳条件为：pH值为8、温度115℃、反应时间5 h、水质量分数为15%。在此条件下重复进行3次试验，得到颜色强度的平均值为1.617，根据卷烟评吸程序得到的评吸得分的平均值为79。总体上来说，美拉德反应产物的香气比较纯正、干净，刺激性小。

2.4.3 美拉德反应产物的GC-MS分析 酶解烟草废弃物进行美拉德反应得到的产物，共检测出100种物质，其中与烟草香味有关的化合物有57种，所占的相对百分含量为71.277%，如图7各种致香成分所占百分比。主要包括吡嗪类、吡咯类、吡啶类、吲哚类、醇类、酸类、呋喃类、酮类、酯类、醛类、酚类、羰基类、芳香族类、烷烃类等，这些物质大多数由美拉德反应产生的，作为烟用香精能产生较好的陈烟香，略带甜香，烟气细顺。

图7 致香成分质量分数Fig.7 Percentage of aroma components

3 结语

作者以烟草废弃物为原料，以还原糖得率为指标，通过单因素试验，确定酶法制备美拉德反应基液的工艺为：质量分数0.2%α-淀粉酶与3%β-淀粉酶，温度为50℃，缓冲溶液pH值为5.4，反应时间为7 h，该条件下还原糖的质量浓度为25.46 mg/mL。该试验为美拉德反应提供了天然又充足的还原糖，节省了原料，使烟草废弃物得到了资源化利用。另外，利用复合酶酶促水解液和外加氨基酸进行美拉德反应，通过正交试验确定最佳反应工艺：外加氨基酸为丙氨酸，pH值为8、温度115℃、反应时间5 h、反应系含水率为15%。在最佳条件下进行的美拉德反应，通过GC-MS可检测出共检测出100种物质，其中与烟草香味有关的化合物有57种，这些物质具有沁鼻的烘烤味和甜香，能改善烟草吸食品质，促进其风味，对卷烟加香能够起到很好的修饰作用。