高效液相色谱法测定原料药中溴芬酸钠及其杂质A含量

董 莉，鲁 军，窦 佳

（辽宁省大连市药品检验所，辽宁 大连 116021）

溴芬酸钠的化学名称为2-氨基-3（-4-溴苯甲酰基）苯乙酸钠，是制备眼部炎症用药的原料。其结构与酮洛芬和双氯芬酸类似，能抑制环氧合酶介导的前列腺素类炎性介质的合成，具有强力消炎镇痛作用，作用强度为其他非甾体抗炎药的10倍［1-5］。其疗效和安全性均较好，特别对于白内障术后眼部发炎、疼痛及畏光症状效果显著［6-13］。本研究中建立的高效液相色谱（HPLC）法可测定原料药中溴芬酸钠及其杂质A的含量，且简便快速、专属性强、准确可靠，可有效控制该药品的质量［14-16］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱；Empower工作站，Waters 2489型紫外／可见光检测器，配备Waters 2998型二极管阵列检测器（Waters公司）；PP-15E型酸度计，MSA 225s-100-DA型分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

溴芬酸钠对照品（批号为WS／BRN／004-07）与溴芬酸钠杂质A对照品（批号为WS／BRW／003-07，纯度为96.8%），均由厂方提供；供试品为进口原料药（Indoco Remedies Ltd，批 号 分 别 为 RK14BRN003，RK14BRN004，RK14BRN001）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：HypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-0.4%三乙胺溶液（用磷酸调pH至5.0）（55 ∶45）；检测波长：266 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：30℃；进样量：10 μL。在此条件下的色谱图见图1。

2.2 溶液制备

取本品20 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀释剂适量，超声处理5 min，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取溴芬酸钠对照品适量，精密称定，加稀释剂制成每1 mL含0.4 mg的溶液，摇匀，作为溴芬酸钠对照品溶液。取杂质A对照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1 mL和供试品溶液0.5 mL，置同一50 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为溴芬酸钠杂质A对照品溶液。避光操作。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察：称取溴芬酸钠对照品10，15，16，18，20，24，30 mg，精密称定，分别置 50 mL 容量瓶中，加稀释剂［甲醇-水（50∶50）］适量，超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为溴芬酸钠线性试验溶液。取溴芬酸钠杂质A［7-（4-溴苯甲酰基）-1，3-二氢-2H-吲哚 -2-酮］对照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置另一50 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液5，7.5，10，15，20 mL，分别置 100 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为溴芬酸钠杂质A线性试验溶液。按2.1项下色谱条件分别进样2次，记录色谱图，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，溴芬酸钠为 Y＝4.658×105X-1.328×105，r＝0.9999（n＝7）；溴芬酸钠杂质 A 为 Y＝2469X+2601，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，溴芬酸钠及其杂质 A质量浓度分别在 0.2 ～0.6 mg／mL 及 0.2 ～0.6 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取室温避光放置 0，4，8，12，24 h 的供试品溶液，分别进样测定。结果峰面积未见明显变化，RSD为1.10%（n＝5），表明该溶液避光放置日内稳定性良好，能满足测定要求。

精密度试验：取批号为RK14BRN003的样品，依法制备供试品溶液，连续进样5次。结果溴芬酸钠的平均含量为 99.99%，RSD 为 0.67%（n＝5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为RK14BRN003）样品5份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果溴芬酸钠平均含量为 99.94%，RSD 为 0.44%（n＝5），表明方法重复性好。

回收率试验：取线性关系考察项下的对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，每份样品各进样2次，测定，取平均值，计算回收率。结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝7）

检出限和定量限确定：按2.1项下色谱条件，取线性关系考察项下溶液，稀释成质量浓度为 4，0.4，0.04，0.004 μg ／mL 的溶液，分别取 10 μL，按拟订色谱条件进样分析。结果检测限按信噪比（S／N）＝3∶1确定为1 ng／mL，定量限按 S／N＝10∶1确定为4ng／mL。

2.4 样品含量测定

精密量取供试品溶液和溴芬酸钠对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件操作，用外标法计算含量。精密量取供试品溶液和溴芬酸钠杂质A对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件操作，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，供试品溶液的色谱图中，如有与杂质A保留时间一致的峰，则按外标法以峰面积计算，不得超过 0.10。详见表 2及图 2。

表2 样品含量测定结果（%）

2.5 强制降解试验

精密量取供试品溶液10 mL，分别精密加入30%过氧化氢溶液、稀盐酸、氢氧化钠溶液各1 mL，供试品溶液于60℃加热1 h后、相对湿度80%放置2 h，供试品溶液于日光照射2 h后，依法制备，即得破坏性试验a，b，c，d，e，f溶液，分别按拟订色谱条件测定。结果表明，该色谱条件可以将溴芬酸钠与各种条件下降解的有关物质分离。除80%相对湿度破坏影响不大外，其他温度、光照有些影响（降解产物质量约增加0.1%），氧化破坏和碱破坏影响较大，而酸破坏时溴芬酸钠几乎全部被破坏。详见图3。

图2 含量测定高效液相色谱图

图3 强制降解试验高效液相色谱图

3 讨论

3.1 色谱柱耐受性考察

分别使用 Thermo BDS Hypersil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）、WatersSymmetryC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）、Unitary C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）以及Kromasil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）等色谱柱分析供试品溶液溴芬酸钠的杂质A与含量，其峰形及分离度均满意，故认为本方法对色谱柱的耐受性良好。

3.2 稳定性考察

经试验，该原料药不稳定，避光放置3～30 d，含量平均下降1% ～2%；对光比较敏感，光照3～30 d，有关物质总含量由0.2%增加到3.5% ～5.0%。供试品溶液颜色由黄色变为橘黄色。这其中溴芬酸钠杂质A的变化不大，而在相对保留时间0.9处及3.5处增加很多，故对其有关物质进行质量控制非常必要。

3.3 检测波长选择

以甲醇为溶剂，分别取溴芬酸钠对照品、溴芬酸钠杂质A对照品制成每1 mL含溴芬酸钠及溴芬酸钠杂质A10 μg的溶液，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果溴芬酸钠及溴芬酸钠杂质A分别在266 nm及270 nm波长处有最大吸收峰。本研究中选择在266 nm波长处测定溴芬酸钠及杂质A的含量，效果满意。

3.4 杂质A考察

用本方法所测得的溴芬酸钠及溴芬酸钠杂质A的含量与梯度试验方法［3］比较，其结果完全一致。且有关物质多检出1个杂质，消除了梯度带来的基线波动造成的干扰，由样品测定和回收率测定结果可知，该方法准确性好，精密度高，重复性好，适用于测定溴芬酸钠原料及其中杂质A的含量。在加入盐酸强制降解试验中，溴被氯取代，且其保留时间与杂质A的保留时间一致。另外，在主峰相对保留时间0.9处均检出含量约0.08%的1个固定杂质，未能确定成分，有待进一步研究。