补中益气丸中相关药味的薄层鉴别补充研究

张永昕 ，李莎恩 ，俞 发 ，王振华 ，李 耿

（1.中国人民解放军第四五八医院，广东 广州 510602； 2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

补中益气丸是由古代名方补中益气汤改变剂型制成的丸剂，由补气药黄芪（炙）、党参、甘草（炙）、白术（炒）、大枣，补血药当归，理气药陈皮，发散风热药升麻、柴胡，发散风寒药生姜10味药组方［1］。其为现代常用升阳益气、调补脾胃的代表方剂，在临床多科多种疾病的治疗中疗效良好［2-7］。当前的中成药质量标准进一步强化了多药味成分的检测［8］，但现行《中国药典》补中益气丸“鉴别”项下，仅对组方中甘草、陈皮、当归3味药进行薄层定性鉴别，不能全面、系统地反映制剂内在质量。本试验中在补中益气丸现行质量标准的基础上，采用薄层色谱（TLC）法对组方中黄芪、柴胡、白术进行了定性鉴别，操作简单，重复性及稳定性好，有益于提升制剂质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Goodsee-Ⅱ型暗箱式薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司）；RE-6000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；TDL-5-A型离心机（上海安亭科学仪器厂）；103B型四两装高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；HH-SII-N14B型电热恒温水浴锅（北京精科华瑞仪器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DT1000型电子天平（江苏省常熟市意欧仪器仪表有限公司）。

试药：补中益气丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号为1500047）；黄芪、甘草、陈皮、党参、当归、升麻、白术、柴胡（均以收货日期为批号，即20160711），打粉，干燥，密封保存，备用；黄芪甲苷（批号为 H-013-140729，纯度为98%），柴胡皂苷 A（批号为C-024-140728，纯度为98%），柴胡皂苷D（批号为C-026-140728，纯度为98%），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；柴胡对照药材（批号为120992-201509），黄芪对照药材（批号为 121462-201304），白术对照药材（批号为120925-201109），均购自中国食品药品检定研究院；甲酸、冰醋酸、硫酸、稀盐酸、碳酸氢钠、三氯化铝、氢氧化钠、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚（60～90℃）、乙醚、二氯甲烷、环己烷、对二甲氨基苯甲醛、香兰素、纯水、中性氧化铝（100～120目）、D101大孔吸附树脂等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芪

2.1.1 溶液制备

取补中益气丸（水丸）3 g，研细，加入甲醇20 mL，加热回流提取1 h，滤过，滤液加于中性氧化铝柱（100～120 目，5 g，内径 1.0 ～1.5 cm）上，以 40%甲醇 100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，药液残渣加入纯化水30 mL，用玻璃棒搅拌溶解，加入新配的水饱和正丁醇萃取2次，每次20mL，合并，取正丁醇萃取液，用纯化水润洗2次，每次20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL溶解，制成供试品溶液。取黄芪对照药材约3 g，按供试品溶液制备方法制备黄芪对照药材溶液。称取适量黄芪甲苷对照品，精密称定，加甲醇，制得质量浓度为1 g／L的对照品溶液。参照补中益气丸中除黄芪外，其他9味药材组方比例和工艺配制阴性对照品，取3 g，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.1.2 薄层色谱鉴别

按2015年版《中国药典（四部）》（通则0502）薄层色谱法试验，分别吸取上述4种溶液各2μL，条带状点样于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，105℃下加热至斑点显色清晰。日光下检视，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同棕褐色斑点，在与黄芪对照药材溶液相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。详见图1。

图1 补中益气丸中黄芪的薄层色谱图

2.2 柴胡

2.2.1 溶液制备

取补中益气丸（水丸）8 g，研细，加入新配的水饱和正丁醇80 mL，超声处理45 min，滤过，以2%氢氧化钠溶液润洗滤液3次，每次50 mL，弃碱水液，取正丁醇液，再用正丁醇饱和的水润洗2次，每次50 mL，弃水液，正丁醇液蒸干，残渣加入甲醇1 mL使溶解，制成供试品溶液。取柴胡对照药材约4 g，按供试品溶液制备方法制得对照药材溶液。取适量柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品，精密称定，加甲醇，制得质量浓度为1 g／L的混合对照品溶液；参照补中益气丸中，除柴胡外，其他9味药材组方比例和工艺制备阴性对照品，取8 g，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.2.2 薄层色谱鉴别

展开剂选择“试验一”：取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）为展开剂，展开取出，晾干，再以乙酸乙酯-乙醇 - 水（18 ∶2 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，放置15 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液与对照药材溶液色谱中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d斑点不能完全分离，方法有待优化。详见图2。

图2 补中益气丸中柴胡的薄层色谱图（1）

展开剂选择“试验二”：取上述4种溶液各5 μL，依次点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（7∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，再以乙酸乙酯 -乙醇-水（14∶2∶1）的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，放置15 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。点板环境要干燥，湿度不能太大。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。详见图3。故此方法可作为柴胡的定性鉴别方法。

图3 补中益气丸中柴胡的薄层色谱图（2）

2.3 白术

2.3.1 溶液制备

样品提取“试验一”：取补中益气丸（水丸）5 g，研细至干燥，置烧瓶中，加正己烷10 mL，超声（180 W，40 kHz）处理15 min，趁热滤过，将滤液低温蒸干，残渣加正己烷1 mL使其完全溶解，制得供试品溶液。取白术对照药材约0.5 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。参照补中益气丸中，除白术外，其他9味药材组方配制缺白术的阴性对照品，取8 g，同法制得阴性对照品溶液。

样品提取“试验二”：取补中益气丸（水丸）5 g，研细至干燥，置烧瓶中，加水300 mL，用玻璃棒搅拌使药粉充分混合均匀，连接回流冷凝管和挥发油测定器。从冷凝管上端加水至刻度，用滴管滴入正己烷2 mL，连接回流冷凝管。缓慢加热至沸腾，保持沸腾状态2 h，停止加热，静置片刻，将水缓缓放出，收集正己烷液，制成供试品溶液［9］。取白术对照药材约 0.5 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。参照补中益气丸中，除白术外，其他9味药材组方配制缺白术的阴性对照品，取8 g，同法制得阴性对照品溶液。

2.3.2 薄层色谱鉴别

分别取上述2种方法制备的供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液各10 μL，依次点于2种方法对应的硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（50∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视。“试验一”中，供试品溶液色谱在与对照药材溶液色谱相应位置上无相同颜色的斑点（见图4），表明供试品溶液的制备方法还有待优化，此方法不可行。“试验二”中，供试品溶液色谱在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰（见图5），表明此方法可作为白术的定性鉴别方法。

图4 补中益气丸中白术的薄层色谱图（1）

3 讨论

薄层色谱法目前广泛应用于中药材和中成药的定性鉴别［10］，但易受样品的预处理、展开剂等相关因素影响［11-12］，故研究中需根据具体中药制剂组方调整薄层鉴别方法，包括改进药典中的样品提取方法和色谱展开条件，以得到斑点清晰、无杂质干扰、重复性好的色谱图［13］。本研究中参考了标准项下的薄层鉴别项，以及药典中相关中药成方制剂处方中相关药材成分的薄层色谱鉴别方法，并借鉴了中药成方制剂和中药材的定性鉴别相关文献，通过多次试验论证，增补和完善了补中益气丸（水丸）中相关药味的薄层色谱定性鉴别方法。

在柴胡的薄层色谱定性鉴别研究中，展开剂的选择非常关键，作为展开剂的溶剂应符合适当的纯度和稳定性、低黏度、线性分配等温线等条件［14］。本试验中通过多次预试验，如采用药典鉴别方法所提供的单次展开无法清楚分开柴胡皂苷a和柴胡皂苷d时，通过借鉴相关文献资料提供的二次展开方法也未能实现完全分离。研究中通过改进，以醋酸乙酯-乙醇-水（7∶2∶1）为展开剂，一次展开，再以醋酸乙酯-乙醇-水（14∶2∶1）进行二次展开，最终选择了适合比例的溶剂作为展开剂，取得了较满意的结果。

在白术的薄层色谱定性鉴别研究中，对展开剂、展开方式和样品提取方式进行了优化［15］。由于其指标成分苍术酮不稳定，故本试验中以白术对照药材为对照物，在供试品溶液制备中借鉴了相关文献中挥发油的提取方法［9］，最终得到了与药典记录一致的明显斑点。建议在补中益气丸的生产工艺中，对白术的炮制可先炮制后切段，从而可减少药材中有效成分的流失。

本试验中，在补中益气丸现有质量标准的基础上，增加了对其中药味黄芪、柴胡、白术的薄层色谱鉴别，进一步完善了补中益气丸的相关质量控制标准。建立的薄层色谱鉴别方法，针对性强，斑点清晰，分离效果好，稳定性及重复性良好，阴性无干扰，可用于补中益气丸（水丸）中上述药味的定性鉴别。不足之处在于，对党参的薄层色谱鉴别探索中，参考了药典中多种对于党参的薄层色谱提取方法，并参阅了各文献中的思路，采用了大孔树脂、中性氧化铝等柱层析方法，可能由于受到补中益气丸中辅料的影响，均表现出色谱斑点不清晰或斑点无法区分，存在阴性干扰，无法取得满意效果，仍需进一步研究。