正交试验优化洋葱多糖提取工艺研究*

马建丽，李 翔，段斯庭，焦美燕，魏婷婷，黎春彤，孟凡爽

（中国人民解放军总医院第一附属医院药剂药理科，北京 100048）

洋葱是药食两用植物，含有硫化物、类黄酮、多糖等主要化学成分，有显著的抗氧化、抗癌、抗血小板聚集、抑菌消炎、降血压、降血糖、调血脂等功效［1］。国内外关于硫化物、类黄酮等物质的研究报道较多，而有关洋葱多糖的研究甚少。洋葱多糖对超氧阴离子自由基、羟基自由基均有较好的清除能力，具有较高的研究价值［2］。本研究中采用热水提醇沉法提取洋葱总多糖，并对提取工艺进行优化，确定了最佳工艺条件，还测定了洋葱多糖含量，为其进一步研究和开发提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BJ-400型高速多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）；DZF-6053型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；N-1100D-W型旋转蒸发仪（爱朗科技国际贸易＜上海＞有限公司）；LD5-2A型离心机（北京京立医疗器械公司）；LGJ-10D型冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂）；Evolution 201型紫外分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 试药

葡萄糖标准品（中国食品药品检定研究院，批号为110833-201707）：无水乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸，均为分析纯；纯化水为本制剂室自制。将新鲜黄皮洋葱（市场购买）切碎，在60℃真空干燥箱中烘至无水分，置40℃电热鼓风干燥箱中烘干，用粉碎机粉碎，制得干燥洋葱粉，备用。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 溶液制备

葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖标准品99.80mg，置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取10 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配置成质量浓度为99.80 μg／mL的标准溶液，避光保存。

5%苯酚试剂：将盛有苯酚的棕色玻璃瓶置60℃水浴锅中，待其融为液态后称取苯酚4.999 g，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，取水稀释至刻度，摇匀，避光保存［3］。

样品溶液：称取洋葱多糖6 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水80 mL，超声30 min，冷却至室温，定容至100 mL，摇匀，备用。

2.1.2 测定波长选择

精密量取溶液0.5 mL，置10 mL试管中，再加入5% 苯酚试剂 0.3 mL，混匀，加浓硫酸 1.5 mL，立即混匀，依次置40℃水浴中放置30 min，冰水浴中放置5 min，测定前放置至室温。在400～650 nm波长范围内扫描，在490 nm波长处有最大吸收，因此确定测定波长为490 nm。详见图1。

图1 样品紫外吸收光谱图

2.1.3 方法学考察

基坑作为作业区必须划出禁区，并设置围栏，带有‘施工现场，行人不得入内’字样的安全警示牌，禁止行人进入，以免造成安全事故。施工人员进入施工现场时，要进行人员审核，并检查施工人员的安全配置是否符合安全管理要求。

线性关系考察：精密吸取葡萄糖标准溶液2，4，6，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，分别加水至刻线，摇匀，得质量浓度为 19.96，39.92，49.90，79.84，99.80 μg ／mL的对照品溶液。按2.1.2项下操作至“测定前放置至室温”，测定吸光度，以进样量（X，μg）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝0.011 5X+0.008 3，R2＝0.994 2（n ＝5），进样量线性范围为 9.980 ～49.90 μg。

精密度试验：精密吸取葡萄糖标准溶液0.5 mL，取6 份，同 2.1.2 项下“加入 5%苯酚试剂 0.3 mL”余下操作，测定吸光度值。结果的 RSD为2.49% （n＝6），表明仪器精密度良好。。

重复性试验：分别称取洋葱多糖提取物6份，精密称定，按2.1.1项下方法处理样品，分别精密吸取此溶液0.5 mL置试管中，同2.1.2项下“加入5%苯酚试剂0.3 mL”余下操作，测定吸光度值。结果洋葱多糖平均含量为 61.84%，RSD 为 2.68% （n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：称取洋葱多糖提取物，精密称定，按2.1.1 项下方法处理样品，精密吸取 0.5 mL，按 2.1.2项下“加入5%苯酚试剂0.3 mL”余下操作，每隔20 min测定吸光度值，连续测定2 h。结果的 RSD为2.54%（n＝7），表明待测溶液在2 h内稳定。

加样回收试验：精密称取6份已知多糖含量（61.84%）的洋葱多糖提取物，每份3 mg，精密称定，分别加入18 mL葡萄糖标准溶液，加水至80 mL，超声处理30 min，冷却至室温，定容至100 mL，摇匀，分别精密吸取此溶液0.5 mL置试管中，同2.1.2项下“加入5%苯酚试剂0.3mL”余下操作，测定吸光度值。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.2 正交试验优化

2.2.1 多糖提取流程

称取10 g干燥洋葱粉，精密称定，以固定料液比与纯净水混合放入烧杯中，将其置电热恒温水浴锅中，在固定提取温度下水浴浸提固定时间，浸提后将其放入离心机中，以3 000 r／min的速率离心5 min，用漏斗将其固液分离，得到的残渣留样，上清液放入旋转蒸发仪减压浓缩至50 mL后取出，备用。

2.2.2 去蛋白纯化处理

加入浓缩液体积1／5的三氯甲烷，再加入三氯甲烷体积1／5的正丁醇，混合后，超声20 min，以3 000 r／min的速率离心5 min，除去变性蛋白质沉淀，取水相，以1∶1的比例加入无水乙醇，静置2 h使多糖沉淀后将其放入离心机中，以3 000 r／min的速率离心5 min，用漏斗将其固液分离，上清液留样，沉淀用丙酮洗涤5次，将得到的多糖沉淀放入冰箱冷冻12 h，再放入冷冻干燥机冷冻干燥，得到多糖［3］。

2.2.3 单因素试验

料液比：分别配置料液比为 1 ∶10，1 ∶15，1 ∶20，1∶25，1∶30的样品5份，置70℃水浴中提取1 h，考察洋葱多糖提取率。

提取时间：分别将预处理好的料液比为1∶20的样品置 70 ℃水浴中，分别提取 1，2，3，4，5 min，考察洋葱多糖提取率。

提取温度：分别将预处理好的料液比为1∶20的样品置 50，60，70，80，90 ℃水浴中，提取 1 h，考察温度对洋葱多糖提取率的影响［4］。

2.2.4 正交试验

选取料液比（因素A）、提取时间（因素B）、提取温度（因素C）作为考察因素，根据单因素试验结果选取考察因素，进行正交试验。因素水平见表2。分别对正交试验所得的9份样品，按2.1项下方法测定含量，并以多糖得率为评价指标，分别对正交试验结果进行分析，结果见表3。3个因素对多糖提取率影响强度为料液比＞提取温度＞提取时间；最佳提取工艺料液比为1∶20，提取温度为70℃，提取时间为2 h，此时洋葱多糖提取率理论上为最大值。

表2 正交试验因素水平表

表 3 L9（33）正交试验结果

2.3 验证试验

以正交试验最佳工艺条件提取3次，结果总多糖的提取率分别为 4.60% ，4.42% ，4.56% ，与预测一致，表明正交试验得到的最佳提取条件重复性好。

3 讨论

3.1 提取方法

文献中常采用热水提醇沉法、超声辅助提取法、回流超声辅助提取法［5-7］提取洋葱多糖。热水提醇沉法的优点是安全、无毒且成本低。提取过程中，由于提取到的多糖较少，故减少其损失显得很有必要，即离心过滤这一步很重要，如果过滤时采用滤纸，会导致多糖很大一部分残留在滤纸上，从而降低多糖的得率，因此在实际过滤中可使用纱布。

查阅相关文献发现，多糖大都采用冷冻干燥［8］，而不用真空干燥，原因是真空干燥会导致提取出来的多糖呈黏弹性，不是理想中的粉末状，而冷冻干燥的效果则很好。

3.2 含量测定

苯酚-硫酸法是测定多糖含量的最常用方法。在浓硫酸作用下，多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，并通过比色法确定含量，该方法具有操作简单、快速、重复性好、显色后稳定性较好等优点，文献中常采用此方法测定多糖含量。蒽酮-硫酸法虽也能测定多糖含量，但稳定性较差，此外，色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定干扰，故一般不采用此法对多糖进行含量测定［9-11］。苯酚-硫酸法的影响因素有反应物的剂量、反应时间、反应的一致性，因此，严格控制3种因素非常必要。测定洋葱多糖的含量时，应将试管倾斜，缓慢加入浓硫酸，待全部加入后，应充分震荡使其完全反应，以免影响试验结果。

3.3 样品前处理

在提取得到洋葱多糖的同时，里面掺杂的蛋白杂质也较多，致使多糖的纯度不高，会直接影响含量测定结果的准确度，加样回收率过高，故本研究采用了有机试剂法去除蛋白质而保留多糖［12-14］。

综上所述，优化后的热水提醇沉法多糖提取率高且含量也很高，苯酚-硫酸法测定多糖含量操作简便，容易实施，重复性好，可作为洋葱多糖的含量测定方法。