IL-6、IL-6R基因多态性与特发性肺动脉高压发病的关系

段智慧，张灿花

(内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050)

特发性肺动脉高压(IPAH)属于临床上少见的致命性疾病，发病率较低，一般表现为肺动脉高压升高以及动脉壁增厚，病情严重者发展为右心衰竭[1]。以往研究认为缺氧是IPAH形成的重要原因，近期研究显示IPAH初期已存在炎性细胞浸润，其中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-6受体(IL-6R)水平升高可促进IPAH的发生发展[2,3]。大量研究[4]显示，单核苷酸多态性(SNP)与IPAH发生、病情严重程度密切有关,而IL-6、IL-6R基因多态性与IPAH发病风险是否相关目前尚无研究。本研究观察了IL-6、IL-6R基因多态性与IPAH发生风险的相关性，为早期预防IPAH提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月～2017年10月内蒙古医科大学附属医院收治的IPAH患者97例(观察组)，男58例，女39例；年龄(61.35±10.44)岁。纳入标准：①患者均符合肺动脉高压世界论坛颁布的IPAH诊断标准[5]，右心导管检测，平均肺动脉压超过25 mmHg，且毛细血管契压<15 mmHg；②患者间无血缘关系；③均为汉族；④知悉本研究并签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准同意。排除标准：①冠状动脉粥样硬化、心力衰竭、门静脉高压；②肺结核、肺栓塞、间质性肺病；③恶性肿瘤以及自身免疫疾病；④肝、肾功能严重受损；⑤近期服用阿米雷司等药物。另选同期在本院体检的健康者80例(对照组)，男49例，女31例；年龄(59.85±9.56)岁。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。

1.2 IL-6、IL-6R基因rs8192284位点多态性检测 ①血液样本收集：所有入选对象均在清晨空腹状态下采集静脉血3 mL，加入抗凝管内，以2 000 r/min离心3 min，加入红细胞裂解液混匀后，以3 000 r/min离心30 s，保存血清，放置-80 ℃进行保存。②基因组DNA提取及两对引物-聚合酶链式反应(PCR-CTPP)检测：采用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，检测其纯度和浓度，OD260/280为1.8～2.0，可用于后续研究。DNA样本稀释到50 μg/L，采用Sequenom软件进行SNP基因分型，IL-6、IL-6R基因rs8192284位点PCR扩增、单碱基延伸引物均由广州Invitrogen公司合成；PCR反应体系共50 μL，Taq Buffer 5 μL，MgCl23 μL，位点T、G(A、C)引物上下游各2 μL，dNTP Mix 1 μL，DNA样本4 μL，Taq DNA 0.5 μL，H2O 28.5 μL。IL-6基因rs1800796位点PCR反应程序设定：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性，30 s；60 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，60 s；40个循环；72 ℃延伸10 min。IL-6R基因rs819228位点的PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物2 μL，在琼脂糖凝胶中进行电泳，至于凝胶成像系统观察电泳条带，回收PCR产物，经上海生工生物公司进行序列测定。③结果判定：根据电泳条带，确定IL-6、IL-6R基因多态性。IL-6基因rs1800796位点：1.野生型纯合子CC型，两条DNA条带，279 bp、179 bp；2.突变杂合子CG型，三条DNA条带，279 bp、179 bp、100 bp；3.突变纯合子GG型，一条DNA条带，279 bp。IL-6R基因rs819228位点：1.野生型纯合子AA型，两条DNA条带，258 bp、188 bp；2.突变杂合子AC型，三条DNA条带，258 bp、188 bp、70 bp；3.突变纯合子CC型，一条DNA条带，258 bp。

2 结果

2.1 PCR-CTPP反应产物电泳及基因型判定 IL-6在rs1800796位点存在单核苷酸多态性，分别为野生型纯合子CC型、突变杂合子CG型、突变纯合子GG型；IL-6R在rs8192284位点存在单核苷酸多态性，分别为野生型纯合子AA型、突变杂合子AC型、突变纯合子CC型;测序验证准确率为100%。

2.2 Hardy-weinberg遗传平衡验证 观察组和对照组IL-6、IL-6R基因型频率实际值与预测值比较均无统计学意义(P均>0.05)，IL-6、IL-6R基因型频率稳定，符合Hardy-weinberg平衡定律。

2.3 两组IL-6基因rs1800796位点基因型及等位基因频率比较 结果见表1。

2.4 两组IL-6R基因rs8192284位点基因型频率及等位基因频率比较 结果见表2。由表2可知，两组IL-6R基因rs8192284位点基因型频率及等位基因频率比较均无统计学差异(P均>0.05)。

表1 两组IL-6基因rs1800796位点基因型及等位基因频率比较

注：与对照比较，*P<0.05。

表2 两组IL-6R基因rs8192284位点基因型及等位基因频率比较

2.5 IL-6基因多态性与IPAH发生风险的相关性 结果见表3。由表3可知，突变杂合基因型CG以及纯合的GG基因型可增加IPAH的发病风险，为IPAH发生的危险基因型。

表3 IL-6基因多态性与IPAH发生风险的Logistic回归分析

2.6 IL-6基因与IPAH患者临床病理参数的关系 观察组CC型、CG+GG型平均肺动脉压分别为(60.05±11.12)、(65.07±9.11)mmHg，心指数分别为(2.12±0.38)、(2.36±0.42)L/(min·m2)，肺血管阻力分别为(24.95±4.37)、(27.85±3.68)WU·m2，两者比较，P均<0.05。观察组CC型年龄(61.50±11.38)岁，男23例、女17例，心功能分级Ⅱ级12例、Ⅲ级6例、Ⅳ级3例，肺毛细血管契压(9.03±1.15)mmHg，心输出量(3.75±0.53)mL；CG+GG型年龄(61.23±9.64)岁，男35例、女23例，心功能分级Ⅱ级43例、Ⅲ级20例、Ⅳ级13例，肺毛细血管契压(9.07±1.11)mmHg，心输出量(3.86±0.66)mL；两者比较，P均>0.05。

3 讨论

IPAH是以肺血管阻力升高为主要特征的血管功能紊乱病症，其发病原因不明，患者预后较差[6]。Hoffmann等[7]对194例IPAH患者预后进行分析，显示患者平均生存期不足3 a。目前临床上无根治IPAH的有效方法，探究IPAH的病因及发病机制是预防、治疗IPAH的重要途径。近年来，IPAH分子遗传学研究成为热点，一些炎症因子基因的多态性能通过影响基因转录、表达进而影响炎症因子活性，从而决定不同个体对IPAH的易感性[8]，因此基因多态性可能是决定个体IPAH易感性差异的分子基础。

人体IL-6基因位于染色体7P15-21位置，该基因多态性位点主要位于启动子区域中的rs1800796G/C、-597G/A，其中rs1800796位于启动子-572(572 C→G)位。IL-6基因多态性可影响IL-6基因的转录和表达，影响IL-6的表达水平，进而影响相关疾病的发生发展与临床表现[9,10]。研究[11]显示，IL-6基因rs1800796位点的多态性与血清IL-6水平相关，位点C→G突变与血清IL-6水平变化相关。Chang等[12]发现，rs1800796位点C→G突变者尿蛋白水平明显高于未突变者，患者发生糖尿病肾病的风险也明显升高。谢军等[13]认为，rs1800796GG基因型突变是胃癌发生的风险因素。目前，在IPAH中未见该基因位点多态性有关报道。本研究显示，IPAH患者IL-6基因rs1800796位点存在多态性，CC型基因较常见，与北京等地有关报道相接近[14]；且观察组中GG基因型频率明显高于对照组，提示IL-6基因rs1800796位点多态性可能与IPAH有关。Logistic分析发现，IL-6基因rs1800796位点突变杂合基因型CG、突变纯合基因型GG与野生纯合基因型CC比较差异显著，表明突变杂合基因型CG以及纯合的GG基因型可增加IPAH的发病风险，推测IL-6基因rs1800796位点C→G突变为IPAH发生的危险基因型。而研究证实，rs1800796位点C→G突变会降低IL-6启动子转录活性，降低患者血清IL-6水平，进而降低脓毒症发生风险，这与本研究结果中C→G突变增加疾病发生风险不符合，分析可能为研究病例受到地理位置、生活环境、种族或实验设计的影响，导致结果出现差异。

IL-6基因rs1800796位点C→G突变可能会对患者临床表现产生一定的影响。有研究显示，IL-6基因rs1800796位点C→G突变会使血清中CRP水平发生变化，进而影响患者临床表现[15]。IPAH最显著的临床特征就是肺动脉压和肺血管阻力持续升高[16]。本研究通过对临床病理参数分析，显示IL-6基因rs1800796位点G基因携带者的平均肺动脉压、心指数、肺血管阻力明显高于CC基因者，表明IL-6基因rs1800796位点C→G突变会促进肺动脉压、肺血管阻力心指数升高，加重病情，心指数增加可能会发心衰。

IL-6R位于人染色体lq21区，其中rs8192284位点位于外显子区域，其A→C突变后引发Ala氨基酸被替代，而该位点位于分子穿模区域，能够改变IL-6R蛋白构象，进而使IL-6R以溶蛋白裂解形式将IL-6R释放至血清中，使血清IL-6R水平升高[17]。目前，对于IL-6R基因rs8192284位点的多态性是否为疾病发生的危险因素尚存在争议。研究[18]显示，IL-6R基因rs8192284位点A→C突变与T2DM易感性降低有关。但也有文献[19]报道认为A→C突变后与患者单纯肥胖相关，而与T2DM的发生无关。而文献[20]报道，IL-6R基因rs8192284位点A→C突变者杂合子携带者出现黑素瘤的风险明显高于纯合子携带者。目前，尚未有文献报道IL-6R基因rs8192284位点基因多态性与IPAH发生的有关性。本研究显示，两组IL-6R基因rs8192284位点基因型频率及等位基因分布无明显差异，提示IL-6R基因rs8192284位点基因多态性与IPAH的发生无关，分析原因可能为IPAH疾病发病原因较复杂，可能与各因素互相作用有关，也可能与病例种族以及研究时基因分型技术有关。

总之，IL-6基因rs1800796位点多态性可能是IPAH发生的一个危险因素，该基因位点GG、CG基因型可增加IPAH的发病风险，但具体机制还有待后续深入研究。