血清miR-1、miR-21在冠心病患者PCI术后病变冠状动脉再狭窄预测中的应用

王红，任明，樊世明，沈有录，赵琼琼

(青海大学附属医院，西宁 810001)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是指冠状动脉血管粥样硬化病变致血管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧、甚至坏死而引起的心脏病[1]。经皮冠状动脉介入术(PCI)是目前临床治疗冠心病的重要手段，但术后再狭窄发生率为10% ～20%，严重影响患者预后[2]。PCI术后冠状动脉造影检查或血管内超声检查是确诊冠状动脉再狭窄的“金标准”，但是此时确诊再狭窄已经延误治疗最佳时机，也可能因二次手术而造成重大疾病负担。寻找灵敏度高、特异度好的标志物早期预测PCI术后冠状动脉扩张部位再狭窄，对降低再狭窄发生率及提高患者预后有重要意义。微小RNA(miRNA)是主要在真核生物中表达的单链小分子RNA，不编码蛋白质，主要介导细胞的增殖、分化、凋亡等病理生理过程[3]。研究[4]发现，miRNA异常表达可能介导了缺血性心脏病发病过程。miR-1和miR-21属miRNA家族成员，两者与恶性肿瘤[5,6]发生发展密切相关，而关于其与冠心病PCI术后冠脉再狭窄的关系目前鲜有研究。本研究通过检测冠心病患者PCI术后血清miR-1、miR-21，并探讨其在术后病变冠状动脉再狭窄预测中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月～2017年12月青海大学附属医院收治的103例行PCI治疗后6个月内的冠心病患者作为研究对象。纳入标准：①临床症状、超声心动图结合实验室检查等确诊为冠心病，并符合冠心病诊断标准[7]；②PCI术后再狭窄的诊断标准[8]：经血管内超声检查提示患者原扩张部位支架内以及节段内的血管腔直径缩小超过50%。排除标准：①孕产妇以及哺乳期的妇女；②肝、肾功能障碍者；③急、慢性炎症性疾病；④自身免疫性疾病；⑤冠状动脉多支病变、血管慢性堵塞再通患者；⑥泵衰竭Killip Ⅲ级以及Ⅲ级以上的患者；⑦恶性肿瘤患者。根据PCI术后6个月患者血管内超声结果提示是否存在再狭窄将所有患者分为两组，再狭窄组42例，男25例，女17例；年龄37～79(56.23±8.91)岁；病变部位在前降支17例，右冠脉20例，回旋支5例。未狭窄组61例，男38例，女23例；年龄41～75(58.12±8.25)岁；病变部位在前降支20例，右冠脉29例，回旋支12例。另选30例同期健康体检者作为对照组，男19例，女11例；年龄35～81(56.98±9.05)岁。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究得到医院伦理委员会的批准，研究对象及家属均在知情同意书上签字。

1.2 血清miR-1、miR-21检测 收集各组清晨空腹肘静脉血5 mL，以3 000 r/min的速度离心10 min，弃去血浆溶液后再以3 000 r/min的速度离心10 min，留取上清液装于未含RNA酶的试管中，置于-80 ℃环境下保存。根据RNAisoTMPlus试剂盒说明提取总RNA，以异丙醇沉淀法浓缩RNA后采用NanoDrop®ND-1000对RNA的浓度进行检测，并评估其纯度。RT-PCR法检测miR-1、miR-21，严格按照RT-PCR试剂盒说明进行相关操作，反应体系20 μL，包括2×Taqman通用的PCR预混物10 μL，20×miRNA特异度引物1 μL，cDNA 1.33 μL，蒸馏水7.67 μL。反应条件：95 ℃变性、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共循环50次，实验重复3次。采用Primer5软件设计引物序列，miR-1：5′-AGCG-GCAGAATCAGGAGTA-3′，5′-GAGGACCTTGGAGGCAG-AC-3′，350 bp；miR-21：5′-GCCCATCCTCAAATACAAAG-C-3′，5′-GGTCCYGAACACAAAATG AGC-3′，335 bp；β-actin：5′-CTCATTGACAATGGTGAT-3′，5′-ACCGAGCGC-GGCTACAGC-3′，650 bp。采用2-ΔΔCt表示miR-1、miR-21的相对表达量。

1.3 血管内超声检查 PCI术后定期门诊随访，并在PCI术后6个月对所有患者行血管内超声检查，检测仪器为Boston Scientific Clearview血管内超声仪。具体步骤：肝素抗凝后将硝酸甘油注入冠状动脉内，超声探头为2.5 F，频率为40 MHz，到达动脉狭窄病变处远段后将探头导管以0.5 mm/s的速度回撤，分别测量支架内病变、病变近端和远段10 mm处各3次。根据美国心脏病学院血管内超声测定指南[9]测量外弹力膜内横截面积(EEM)、最小管腔面积(MLA)、斑块面积(PLA)，并计算狭窄程度(RS%)。

2 结果

2.1 各组血清miR-1、miR-21表达比较 结果见表1。

表1 各组血清miR-1、miR-21表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与未狭窄组比较，△P<0.05。

2.2 两组血管内超声检查相关指标比较 结果见表2。

表2 两组血管内超声检查相关指标比较

注：与未狭窄组比较，*P<0.05。

2.3 血清miR-1、miR-21与血管内超声检查相关指标的相关性 狭窄组患者血清miR-1与miR-21表达呈负相关(r=-0.762，P<0.05)，miR-1与EEM、MLA呈正相关(r=0.611、0.572，P均<0.05)，miR-1与PLA、RS呈负相关(r=-0.538、-0.615，P<0.05)；血清miR-21表达与EEM、MLA呈负相关(r=-0.593、-0.624，P均<0.05)，与PLA、RS呈正相关(r=0.509、0.637，P均<0.05)。未狭窄组患者血清miR-1与miR-21表达无明显关系(P>0.05)，miR-1、miR-21与EEM、MLA、PLA、RS无相关(P均>0.05)。

2.4 血清miR-1、miR-21预测冠心病患者PCI术后再狭窄的价值 当miR-1的AUC为0.770(95%CI0.676～0.864)，此时最佳截断值为0.36，诊断再狭窄的灵敏度、特异度分别为0.82、0.87，准确性为0.83；当miR-21的AUC为0.750(95%CI0.648～0.852)，此时最佳截断值为0.79，诊断再狭窄的灵敏度、特异度分别为0.79、0.85，准确性为0.80；miR-1联合miR-21的AUC为0.928(95%CI0.877～0.980)，诊断再狭窄的灵敏度、特异度分别为0.89、0.93，准确性为0.87。详见图1。

3 讨论

近年来，随着社会节奏的加快及生活压力的增大，冠心病发病率逐渐增加，并呈年轻化趋势，严重威胁人们的健康和生命质量[10]。PCI是目前临床治疗冠心病的重要手段，它能有效减少不稳定性心绞痛患者病死率，提高非致死性心肌梗死、难治性心绞痛患者预后[11]。再狭窄是指PCI术后6个月行冠状动脉造影发现冠状动脉血管管腔直径缩小超过50%，其形成机制主要是血管内膜过度增殖[12]。文献[13]报道，PCI过程易损伤动脉血管内皮细胞，引起炎症反应、血栓、血管内膜异常增殖等，进而形成血管新生内膜、血管重塑等，最终导致血管再狭窄。冠心病患者PCI术后如何减少扩张部位再狭窄，提高预后已成为临床研究热点。

图1 血清miR-1、miR-21预测冠心病患者PCI术后再狭窄的ROC曲线

miRNA长度约为18～25个核苷酸，是由内源基因编码的非编码单链小分子RNA，它通过互补配对的方式与3′端片段特异度结合而抑制mRNA的正常合成，进而调控靶基因的表达[14]。研究[15]表明，miRNA参与了心血管疾病、恶性肿瘤的发生发展过程。Wang等[16]认为，miR-1、miR-208、miR-133在急性心肌梗死患者中表达异常，证实miRNA可作为心肌损伤的重要标志物。Meder等[17]通过研究miR-145、miR-30c与肌钙蛋白的关系证实miRNA介导了心脏疾病的发病过程。miR-1为肌细胞特异度miRNA，其表达上调对心室肌细胞的增殖具有抑制作用[18]。张亦等[19]发现，miR-1在动脉粥样硬化闭塞症、行血管重建术后再狭窄患者病变的动脉血管中表达下调，再狭窄患者尤其明显。Jiang等[20]认为，miR-1通过表达上调而调控主动脉收缩型血管平滑肌细胞中血管平滑肌细胞的收缩能力和增殖水平。miR-21属于miRNA家族成员，其在大鼠颈动脉球囊血管成形术后表达上调，而抑制miR-21表达后，发现细胞凋亡增加[21]。另有研究[22]也发现，miR-21异常表达参与了心脏疾病的发生过程。

本研究显示，再狭窄组、未狭窄组患者血清miR-1表达低于对照组、miR-21表达高于对照组，再狭窄组血清miR-1表达低于未狭窄组、miR-21水平高于未狭窄组，提示miR-1、miR-21与冠心病患者PCI术后再狭窄有关，可能是因为miR-1、miR-21异常表达促进冠状动脉血管内膜细胞的异常增殖，导致血管新生内膜形成和血管重塑，最终发生血管再狭窄现象。本研究还显示，再狭窄组患者EEM、MLA低于未狭窄组，PLA、RS高于未狭窄组，提示EEM、MLA、PLA、RS是评估动脉血管腔狭窄程度的重要指标。

相关性分析显示，狭窄组患者血清miR-1与miR-21水平呈负相关；miR-1与EEM、MLA呈正相关，与PLA、RS呈负相关；miR-21与EEM、MLA呈负相关，与PLA、RS呈正相关；提示miR-1、miR-21通过协同作用促进冠心病患者PCI术后再狭窄的发生。AUC显示，miR-1、miR-21对冠心病患者PCI术后再狭窄具有较高的预测价值，且联合检测能明显提高预测价值。

总之，miR-1、miR-21异常表达与冠心病患者PCI术后再狭窄密切相关，早期联合检测能有效预测PCI术后再狭窄，可为临床制定针对性干预方案，提高患者预后提供重要参考。