果糖饮食致大鼠肠内菌群的变迁及双歧杆菌干预作用的研究*

林雅玲，王文递，许昕瑜，王明亮，宋彬妤，刘晓梁，郭松佳，吴惠文

（山西医科大学汾阳学院，山西 汾阳 032200）

人体肠道内定居大量的微生物，其编码的基因数量约是人体自身基因的100倍[1]。肠道菌群结构变化与人类代谢疾病的发生关系密切，膳食结构的变化会引起肠道菌比例的改变，从而对机体的代谢产生诸多影响。动物及人体研究均发现，高脂饮食致宿主发生肥胖且肠道内拟杆菌门/厚壁菌门比例下降[2-3]。近年来研究表明[4]，果糖摄入增加与代谢疾病的发生关系密切。本研究拟通过高果糖饮食复制大鼠代谢疾病模型，探讨动物肠道内拟杆菌属、乳杆菌属和梭杆菌属3种菌属丰度变化情况及双歧杆菌干预效果。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

30只雄性SD大鼠，体重200～220 g（购自山西医科大学实验动物中心），随机分为对照组（normal control, NC组），果糖组（high fructose diet, HFD组），双歧杆菌组（Bifidobacteria, B组），每组各10只。NC组，普通饲料+自来水；HFD组，普通饲料+10%果糖水；B组，普通饲料+10%果糖水+双歧杆菌水（1ml/d，1×109cfu/ml）灌胃。于16周末收集大鼠粪便。大鼠禁食12h，乙醚麻醉大鼠，腹主动脉采血并分离血浆，取部分肝组织置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 主要试剂及仪器

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及三酰甘油（TG）测定试剂盒购于南京建成公司，脂多糖（LPS）鲎试剂盒购于美国R&D公司，大鼠胰岛素ELISA试剂盒及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）ELISA试剂盒购自上海西唐公司，粪便总DNA提取试剂盒及荧光定量预混试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，HAP纯化合成方法。双歧杆菌活菌复合制剂购于山东向日葵生物科技有限公司（含活菌1×1011cfu/g）。快速血糖仪（罗氏活力型）。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 体重及血糖 检测每周监测大鼠体重变化，于16周末空腹尾静脉采血，通过快速血糖仪检测空腹血糖（FBG）水平。

1.3.2 ALT、AST、TG、LPS及胰岛素抵抗指数 采用酶法测定ALT、AST及TG；鲎试剂法检测LPS水平；ELISA法检测大鼠血浆TNF-α水平和空腹胰岛素（FINS）水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mu/ml）/22.5。

1.3.3 肝组织病理学 检测取4%多聚甲醛溶液，固定肝组织，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理学变化。

1.3.4 肠道菌群基因组DNA 提取16周末采集的大鼠粪便，于大鼠排便后迅速分装于密闭无菌粪便储存盒中并将标本储存于-80℃低温冰箱中。称取200 mg样品采用粪便总DNA提取试剂盒提取总菌DNA，微量核酸定量检测仪检测DNA浓度。

1.3.5 引物及实时聚合酶链反应（real-time PCR）根据文献[5-7]合成引物（见表1）。运用PCR技术分别对总菌、拟杆菌属、乳杆菌属和梭杆菌属的基因进行扩增。PCR的反应体系20μl：2×Super Real Color Premi×10μl，正反向引物各0.6μl（10μmol/L），模板75～100ng。PCR反应条件：95℃ 15min；95℃30s，退火30s，72℃ 45s，39个循环 ；72℃ 5min。观察各菌属在果糖饮食及双歧杆菌干预后丰度变化。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，体重变化采用重复测量设计的方差分析，相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重

3组大鼠体重比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的体重有差异（F=7222.554，P=0.000）；②3组体重有差异（F=34.772，P=0.000）；③ 3 组体重变化趋势有差异（F=344.756，P=0.000）（见表2）。从7周开始，HFD组较NC组体重增长速度加快（见图1A），B组从第13周开始较HFD组增长速度减慢（见图1B）。

2.2 ALT、AST、TG、LPS及TNF-α水平

3组大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与NC组比较，HFD组 ALT、AST、LPS、TG 及 TNF-α 升高（t=5.445、4.971、18.519、8.081和 12.142，均P=0.000）；与 HFD 组比较，B组ALT、AST、LPS、TG及TNF-α降低（t=5.009、3.921、11.151、4.679和6.786，均P=0.000）；与NC组比较，B组LPS、TG及TNF-α升高且差异有统计学意义（t=7.368、3.652和5.356，P=0.000、0.005和0.000）。见表 3。

2.3 FINS、FBG及HOMA-IR评估

3组大鼠FINS、FBG及HOMA-IR比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；HFD组 FINS、FBG 及HOMA-IR与NC组比较，HFD组升高（t=4.209、8.217和10.983，均P=0.000）；B组与HFD组比较，各指标降低（t=3.149、5.874和8.274，均P=0.000）；B组FBG及HOMA-IR较NC组升高，差异有统计学意义（t=2.542和2.889，P=0.037和0.019）。见表4。

表2 3组大鼠每周体重均值表（n =10，g）

图1 大鼠体重变化

表3 3组大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α水平比较（n =10，±s）

表3 3组大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α水平比较（n =10，±s）

注：1）与NC组比较，P ＜0.05；2）与HFD组比较，P ＜0.05；3）与NC组比较，P ＜0.05

组别 ALT/（u/L） AST/（u/L） LPS/（EU/L） TG/（mmol/L） TNF-α/（ng/ml）NC 组 54.70±8.33 119.5±8.40 0.09±0.01 0.44±0.07 0.72±0.09 HFD 组 79.73±7.61） 178.2±27.251） 0.21±0.021） 1.06±0.161） 1.59±0.131）B 组 58.21±5.92） 135.5±14.252） 0.15±0.012）3） 0.70±0.112）3） 1.10±0.112）3）F值 20.925 14.133 173.995 32.878 74.059 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 3组大鼠FINS、FBG及HOMA-IR结果比较（n=10，±s）

表4 3组大鼠FINS、FBG及HOMA-IR结果比较（n=10，±s）

注：1）与NC组比较，P ＜0.05；2）与HFD组比较，P ＜0.05；3）与NC组比较，P ＜0.05

组别 FINS/（mu/L） FBG/（mmol/L） HOMA-IR NC 组 19.90±1.78 4.02±0.68 2.97±0.38 HFD 组 27.70±4.981） 7.67±0.361） 9.36±1.461）B 组 21.70±1.682） 5.06±0.942）3） 4.54±0.512）3）F值 35.835 8.117 65.478 P值 0.000 0.006 0.000

2.4 肝组织病理学改变

NC组（见图2A）肝脏呈暗红色，无油腻感，镜下可见肝索呈放射状排列；HFD组（见图2B）肝脏体积增大，肉眼可见脂肪堆积，呈淡黄色，边缘钝圆，镜下可见胞内有脂滴空泡；B组（见图2C）细胞内脂滴空泡体积和数量较HFD组均减小。

2.5 菌属丰度检测结果

如图3所示，与NC组比较，HFD组的拟杆菌属、乳杆菌属丰度降低，梭杆菌属丰度增加，差异有统计学意义（t=6.131、5.023和5.811，均P=0.000）；与HFD组比较，B组拟杆菌属、乳杆菌属丰度增加，梭杆菌属丰度降低，差异有统计学意义（t=3.327、4.947和3.913，P=0.009、0.000和0.003）；B组3组菌属与NC组比较，差异有统计学意义（t=2.477、3.273和3.092，P=0.039、0.004和0.013）。LPS水平与各组乳杆菌属丰度呈负相关（r=-0.637，P=0.016），与梭杆菌属丰度呈正相关（r=0.771，P=0.001）。

图2 各组肝组织病理切片图（n =10，HE×100）

图3 各菌属相对丰度比较

3 讨论

代谢性疾病发病率逐年升高已成为当前严重的公共卫生问题，其发病与遗传、生活方式及饮食习惯关系密切。近年来研究发现，果糖摄入增加与代谢疾病发生密切相关。流行病学调查研究表明，果糖摄入量与非酒精性脂肪肝病炎症水平呈正相关[8]。高果糖饮食可引起人体胰岛素抵抗和肥胖等代谢疾病[9]。本实验通过10%的果糖水喂养大鼠8周即发现，动物体重增加，肝脏损伤（肝细胞脂变、ALT、AST增高），胰岛素敏感性降低（HOMA-IR增高）。可见，高果糖饮食大鼠可作为复制代谢疾病的理想模型。

肠道菌群失调与代谢疾病的发生密切相关。TURNBAUGH等[2]通过对154例受试者的肠道菌群分析发现，肥胖者肠道的细菌多样性降低而且拟杆菌门丰度降低。MUSSO等[10]在临床实验中指出，糖尿病患者肠道菌群中肠杆菌科等细菌丰度增加而双歧杆菌减少。研究普遍认为，膳食结构的改变可引起肠道菌群失调。CANI等[3]发现，高脂饮食喂养的肥胖小鼠肠道中拟杆菌门/厚壁菌门比例下降。HSIEH等[11]在一项动物实验中发现高果糖饮食大鼠的肠道菌群中双歧杆菌含量下降，而毒性梭状芽胞杆菌含量升高。本实验也发现，模型组大鼠粪便中出现的拟杆菌属、乳杆菌属占总菌比例减小，梭杆菌属占总菌比例增加，而在双歧杆菌组中上述菌属的失调及宿主的代谢紊乱得到改善。由此推测，高果糖膳食引起肠道菌群紊乱在机体代谢异常中发挥一定作用。膳食结构改变引起肠道菌群紊乱可通过多方面促发代谢疾病。膳食可通过使肠道菌群失调引起全身慢性低度炎症，促进代谢疾病的发生。研究表明，肠道菌群紊乱可引起肠道屏障功能受损[12-13]，肠道通透性降低，导致代谢性内毒素血症，LPS通过炎症机制促进肥胖、IR等代谢疾病的发生[14]。本实验中，模型组大鼠血浆LPS、TNF-α水平升高，且LPS水平与乳杆菌属丰度呈负相关，与梭杆菌属呈正相关，且在双歧杆菌干预后，大鼠血浆LPS、TNF-α水平降低，进一步证实果糖饮食引起肠道菌群紊乱通过炎症机制在代谢疾病发病中发挥一定的作用。肠道菌群紊乱可通过引起能量代谢异常参与代谢疾病的发生。有研究发现[15]，高脂饮食小鼠肠道内丁酸含量降低，其可使宿主食物摄入增多，肠蠕动减慢[16-17]，引起机体能量代谢异常，促进代谢疾病的发生。实验发现，果糖膳食大鼠肠道内2种产丁酸的菌属丰度发生了不同变化（拟杆菌属丰度下降，梭杆菌属丰度增加），但本实验未研究肠道菌群失调对大鼠肠道内丁酸含量的影响，此点仍需做进一步的研究；双歧杆菌干预有助于调节菌属失调，并对果糖膳食大鼠肥胖、IR及肝脏损伤起改善作用。

综上所述，果糖饮食引起3种菌属失调参与机体代谢异常的发生，双歧杆菌通过调节其失调对机体代谢紊乱发挥改善作用。