银连解毒口服液提取工艺研究

赵增成 ， 李桂明 ， 宋敏训 ， 李 颖 ， 杨世发 ， 黄中利 ， 冯敏燕 ， 傅 剑 ， 林树乾

(山东省农业科学院家禽研究所 ， 山东济南250023)

银连解毒口服液是我们研发的新兽药，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、牛蒡子、竹叶、甘草等组成。功效为辛凉解表，清热解毒，可用于家禽温热疾病的防治。因处方中，薄荷、荆芥含有挥发油成分，且具有重要的生物活性，因此先采用共水蒸馏法对薄荷、荆芥进行了挥发油提取，提取后的药渣与剩余药味再进行煎煮水提。为了筛选出最佳的提取工艺参数，对提取工艺中的最重要影响因素加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数进行了筛选研究。

1 材料与方法

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪、AB265-S型双量程十万分之一电子天平、KQ5200DB型超声仪、挥发油测定器。

1.2 药品与试剂 绿原酸对照品、牛蒡苷对照品，均购自中国食品药品检定研究院。各中药饮片，购自济南宏济堂药店。乙腈为色谱纯试剂，甲醇、磷酸均为分析纯试剂。

1.3 挥发油提取工艺筛选 为了筛选出薄荷、荆芥中挥发油的最佳提取条件，提高挥发油提取率，采用单因素试验对影响挥发油提取率的主要因素提取时间、加水量、浸泡时间进行考察。

1.3.1 加水量的考察 按处方比例，称取薄荷60 g、荆芥40 g，共100 g，分别加入6倍、8倍、10倍量的水，用挥发油测定器进行蒸馏，提取5 h，记录出油量。

1.3.2 浸泡时间的考察 称取薄荷60 g、荆芥40 g，共100 g，加入8倍量的水，分别浸泡0.5 h、1 h、2 h，用挥发油测定器进行蒸馏，提取5 h，记录出油量。

1.3.3 提取时间的考察 称取薄荷60 g、荆芥40 g共100 g，用挥发油测定器进行蒸馏，分别在开始回流后的不同时间，记录出油量。

1.4 中药浸泡时间筛选 中药的浸泡时间与吸水率对提取有一定的影响，但中药的浸泡一般按完全浸透为原则。取处方量的中药饮片1 000 g，加入6倍量的水浸泡，每间隔0.5 h，观察1次浸润程度，并将水过滤尽，称量湿药重量，计算吸水率，记录吸水率达到饱和的时间。

吸水率=(药材湿重-药材干重)/药材干重×100%

1.5 煎煮工艺筛选 在确定了药材浸泡时间后，采用正交试验对本品煎煮工艺进行了筛选研究，选定加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素，以干膏量、绿原酸含量和牛蒡苷含量为评价指标，对最佳提取工艺进行优选。

1.5.1 试验设计 选取中药加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C) 3个因素，进行3因素3水平筛选试验，因素水平试验设计见表1。选用正交表L9(34)进行正交试验设计[1-2]，共进行9组试验，正交试验方案见表2。

1.5.2 试验方法 按处方比例称取相同的中药饮片共9份，每份1 000 g，其中薄荷、荆芥取蒸馏后的药渣，按表2试验条件分别进行煎煮，滤过，煎煮液最后浓缩至1 g/mL。

表1 煎煮工艺因素水平表

表2 煎煮工艺正交试验

取蒸发皿9个，105 ℃干燥至恒重，精密称定其重量。分别精密吸取所制备的9份中药浓缩液各10 mL至上述蒸发皿中，水浴蒸至近干，置105 ℃干燥3 h，转移至干燥器中冷却0.5 h，精密称定，所得重量减去蒸发皿重量，即得干膏重量。

分别对制备的9份中药浓缩液，按制定的银连解毒口服液质量标准草案，以高效液相色谱法(HPLC)对绿原酸、牛蒡苷含量进行测定。

1.5.3 绿原酸含量测定 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)为流动相；检测波长为327 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。

对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

供试品溶液的制备：精密量取本品2 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声20 min，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.5.4 牛蒡苷含量测定 色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.4%磷酸溶液(25∶75)为流动相，检测波长为277 nm，理论板数按牛蒡苷峰计算应不低于1 000。

对照品溶液的制备：取牛蒡苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.6 mg 的溶液，即得(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备：精密量取本品5 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超声20 min，混匀。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定，即得。

1.5.5 统计方法 以干膏量、绿原酸含量、牛蒡苷含量作为评价指标，设定三者的加权系数分别为0.4、0.3、0.3，采用综合加权评分法，计算出各次试验的综合评分。具体评分方法：以干膏重量最大的1次试验判为100分，按照每次试验干膏量与最大干膏量的比例，计算各自干膏量指标中的得分。同法，分别计算每次试验的绿原酸和牛蒡苷含量得分。最后按照3项指标的加权系数，计算出各次试验的综合评分。

根据综合评分结果，采用极差法进行最佳因素排序，并得出最优组合。采用方差分析，得出各因素对评价指标的显著影响程度。

2 结果与分析

2.1 挥发油提取结果

2.1.1 不同加水量挥发油提取结果 加水量对挥发油提取量具有一定的影响，加8倍量水时，挥发油提取量最多。详见表3。

表3 不同加水量薄荷、荆芥挥发油累计提取量 (mL)

2.1.2 不同浸泡时间挥发油提取结果 中药浸泡时间对挥发油提取量影响不明显，本着节约时间和提高效率的原则，浸泡时间确定为0.5 h。见表4。

2.1.3 不同蒸馏时间挥发油提取结果 试验表明，加热蒸馏1 h内出油最快，且已基本提尽，综合考虑能源的节约，提取时间选择为蒸馏1 h。见表5。

表4 不同浸泡时间薄荷、荆芥中挥发油累计提取量 (mL)

表5 不同时间薄荷、荆芥中挥发油提取量

2.2 药材浸泡时间及吸水率考察结果 不同浸泡时间药材的吸水率情况，见表6。

表6 不同浸泡时间药材吸水率

由表6可知，当浸泡2 h时，吸水已达到饱和状态，此时药材已完全浸透，吸水率为 220% ，因此确定药材最佳浸泡时间为2 h。

2.3 煎煮工艺正交试验结果 正交试验的结果见表7，方差分析结果见表8。

表7 正交试验结果

表8 正交试验结果方差分析

极差直观分析结果表明，影响因素大小为C>A>B，即煎煮次数>加水量>煎煮时间。优选条件为A3B3C3。

方差分析结果表明，A(加水量)、B(煎煮时间)、C因素(煎煮次数)对评价指标均具有显著影响(P<0.05)。

综合分析以上结论，最佳工艺参数选择为：加水量为10倍药量，煎煮时间为1.5 h，共煎煮3次。

3 讨论

3.1 本试验确定出了处方药物薄荷、荆芥的挥发油最佳提取工艺，即将中药饮片加8倍量水，浸泡0.5 h，蒸馏提取1 h，可取得最佳的提取效益。

3.2 通过浸泡试验和正交试验，综合考虑干膏量、绿原酸含量、牛蒡苷含量3项评价指标，将最佳煎煮工艺确定为：加水量为10倍药量，浸泡2 h，每次煎煮1.5 h，共煎煮3次。

3.3 薄荷、荆芥中含有大量的挥发油成分，现代研究表明，挥发油具有抗炎、抗病毒、抑菌、解热镇痛等作用[3-4]，是不可缺少的有效成分，发挥着重要的治疗作用。但挥发油有非常强的挥发性，且水溶解性较差，不能大量溶解于水[5-6]。如果将薄荷、荆芥与其他的药物放在一起直接煎煮，挥发油成分就可能全部损失掉，严重影响药物的疗效。因此，将薄荷、荆芥采用了先单独提取挥发油的生产工艺。

3.4 本制剂中金银花清热解毒、辛凉透表为主药，牛蒡子疏散风热、解毒利咽为臣药。金银花的主要活性成分为绿原酸，牛蒡子的主要活性成分为牛蒡苷，它们均是重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒等作用[7-8]，因此将绿原酸、牛蒡苷含量作为工艺筛选的评价指标。