宠物园犬腹泻病原的分子鉴定分析

张学勇 ， 简莹娜 ， 李秀萍 ， 王戈平 ， 蔡其刚 ， 王光华 ， 马利青

(1.青海大学畜牧兽医科学院 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室 ， 青海西宁810016 ；2.青海省畜牧兽医科学院 ， 青海西宁810016)

宠物犬作为现代生活中重要的伴侣动物，越来越受到人们的喜爱，但是犬的疾病特别是腹泻疾病及其引起的其他症状，严重时可导致犬死亡，严重危害养犬业的健康发展；同时，犬携带的一些人兽共患性病原，随着犬的活动及其与人们的亲密接触，也是一个重要的公共卫生问题，所以有必要对其主要病原进行有效的确诊鉴定。目前，虽然临床上治疗犬腹泻的药物很多，但是多数情况下却简单采用抗生素类药物治疗，有时不能做到有效治疗；同时兽医临床中缺少必要的实验室诊断方法，不能准确诊断出致病性的各种病原。引起犬腹泻的主要病原有细菌性病原、病毒和寄生虫病原，细菌菌群为肠道内常在菌，故本文未对细菌(主要是大肠杆菌和沙门菌)进行检测鉴定；寄生虫性病原有线虫、钩虫、蛔虫、绦虫、球虫、隐孢子虫和贾第鞭毛虫等；病毒性病原主要有犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、犬冠状病毒和犬轮状病毒感染等。此宠物园犬只均进行了疫苗接种和药物驱虫。

本研究通过对腹泻性疾病的犬粪便样品进行PCR分子鉴定，确诊引起犬腹泻的主要病原，针对性地对病毒性和寄生虫性病原，合理采用对症治疗、对因治疗和辅助支持治疗方法进行全面有效的救治预防，以期为临床上有效防治犬腹泻提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品 按照采样要求，对有多次腹泻症状的犬，观察其粪便状态、颜色及无明显脓血等症状的样品进行采集，无菌收集新鲜粪便1 g左右，放于保存液中冰盒及时运至实验室进行分析。

1.2 主要试剂与仪器 PremixExTaq和DNA Marker DL-2 000均购自宝生物工程(大连)有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒自购自天根生化科技(北京)有限公司；病毒RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒，购自凯杰(Qiagen)生物技术有限公司；PCR引物合成及PCR产物测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成，其他均为国产常规试剂。主要仪器包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统等。

1.3 基因组DNA和病毒RNA的提取 利用天根生化科技(北京)有限公司粪样DNA提取试剂盒对粪样进行基因组DNA的提取，利用Qiagen病毒RNA提取试剂盒提取粪样中的病毒RNA，具体的操作步骤均参考试剂盒说明书进行。

1.4 PCR分子鉴定分析 参照反转录试剂盒将提取的病毒总RNA反转录得到cDNA，依次为模板进行PCR扩增；PCR引物序列及其相关信息详见表1；PCR扩增酶为宝生物工程(大连)有限公司的PremixTaq酶，扩增反应体系如下：PremixTaq25.0 μL，上下游引物(浓度10 μmol/L)各2 μL，模板DNA3 μL，补充水18 μL 至PCR反应体系为50 μL。扩增后PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳(电压120 V， 时间30 min)，电泳完成后在凝胶成像仪中观察结果并拍照。测序结果经峰图分析后，在GenBank上用采用BLAST方法进行同源序列搜索，应用MEGA 5.0软件和Clustal Omega在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列同源性的分析。

表1 犬腹泻相关病原的PCR分子鉴定所用引物

2 结果与分析

基于隐孢子虫18S rRNA 基因进行PCR扩增出约587 bp的目的片段(如图1A)，4(4/18)例隐孢子虫阳性均为犬隐孢子虫(Cryptosporidiumcanis)。基于贾第鞭毛虫β-giardin 基因进行PCR扩增出约511 bp的目的片段(如图1B)，6(6/18)例贾第鞭毛虫阳性的基因型包括Giardiaintestinalisassemblage B(n=1)、C(n=2)和D(n=3)。基于犬瘟热病毒CDV-H基因，未扩增到目的片段；基于犬细小病毒CPV-VP基因进行PCR扩增出约568 bp的目的片段(如图1C)，犬细小病毒阳性为CPV2型(18/18)。

3 结论与讨论

犬腹泻的致病因素很多且非常复杂，这个宠物园的18只患犬主要是病原感染引起的腹泻，包括病毒性感染(100.0%)腹泻和寄生虫性感染(44.4%)，可见犬只均为带毒带虫的隐性感染状态。本次通过对病犬的粪便进行病原性诊断，发现病毒性腹泻主要由犬细小病毒引起，症状明显且死亡率高[5]；寄生虫性腹泻常由隐孢子虫、贾第鞭毛虫等引起[6]。本次患病犬只均在宠物园饲养管理下生长，疫苗预防和营养保健管理可视为相同，生活环境相同，故不考虑环境应激和饲养管理。犬只腹泻的原因是由多种病原相互作用引起的，大肠杆菌菌群常在肠道存在且处于生态平衡状态；隐孢子虫和贾第鞭毛虫也为条件性致病性原虫；当犬只的免疫力下降，机体环境变化而菌群失调时，腹泻病就暴发了，此次诱因是感染了犬细小病毒。坚持预防为主、治疗为辅的原则，实施“防重于治”的方针，按时按程序进行犬只的传染病疫苗免疫，提高免疫力。准确鉴别诊断病原尤为重要，这样才能为采取对因治疗、对症治疗和辅助支持疗法措施提供科学依据。

图 1 各病原检测基因PCR扩增结果A:隐孢子虫18S rRNA 基因 ; B:贾第鞭毛虫β-giardin基因 ； C:犬细小病毒VP基因

M: DL-2 000 bp DNA相对分子质量标准； P+：阳性对照；N-：阴性对照； 1-4、5、6：样品1-4、5、6