对虾急性肝胰腺坏死综合症双重PCR检测方法的建立

邓 艳 ， 黄燕琼 ， 戴 金 ， 何淑华 ， 赵尚志 ， 柏建山

(广州机场出入境检验检疫局 ， 广东广州510470)

对虾急性肝胰腺坏死综合症2009年最早在中国发生，2010年和2011年越南和马来西亚先后报道了该病，此后，泰国、墨西哥，南美洲等国家和地区先后都有该病的报道[1-4]。该病病情发展十分迅速,而且死亡率极高。2013年初确认该病病原是一种特殊的副溶血弧菌，专业上称为急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPND)[5]。与非致病性的副溶血性弧菌相比较，AHPND携带了特殊质粒的特异性副溶血弧菌，该质粒上带有与光杆菌同源的昆虫相关毒素PriA和PriB的编码基因[6]。本研究建立了可以同时检测AHPND 的冷休克蛋白基因(CSP)和毒素基因的双重PCR方法，并用此方法对2016-2017年广州白云机场口岸进境的草虾进行了监控。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器Taq酶套装、TaKaRa MinBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KIT、MiniBEST Plasmid Purification Kit,购自宝生物工程(大连)有限公司，APW培养基、TCBS培养基、弧菌显色培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；C1000 Touch PCR仪为Bio-rad公司产品；3K15高速离心机为Sigma公司产品； MULTISKAN GO全波长读数仪为ThermoFisher公司产品。

1.2 样品 2016年1月至2017年7月采集从广州机场口岸进境的草虾共118份，来源地为越南、泰国和马来西亚等东南亚国家。

1.3 样品处理 无菌采取对虾的肝胰腺组织，3种方式处理后分别抽提DNA。第1种方式是直接用肝胰腺组织抽提DNA，第2种方式按照1∶10的比例将肝胰腺组织放入3%APW培养液中，37 ℃培养过夜，用培养液抽提DNA。第3种方式取第2部分的培养液划TCBS平板和弧菌显色平板， 37 ℃培养过夜。在TCBS平板上挑取2～3 mm，表面光滑的绿色单个菌落，弧菌显色培养基上挑取品红色单个菌落，37 ℃培养过夜后抽提菌液DNA。

1.4 PCR引物设计 根据质粒pVPA3-1序列(NC_025252.1)设计两对PCR引物。引物序列分别为：AB1：5′ TGACTATTCTCACGATTGGACTG 3′; AB2：5′ GCCATGTAAGTAATTTGAAGACT 3′；CSP1：5′TCGGTAAGATCAAAAACTACAAAGAC3′; CSP2：5′ CCTGACATTAACTTCCCATACTTGC 3′，产物长度分别为843 bp和666 bp。引物AB1和AB2扩增产物包括部分PriA和PriB基因，引物CSP1和CSP2扩增产物为部分CSP基因。

1.5 PCR反应体系和反应条件 PCR反应体系的最终体积为25 μL，其中10×PCR缓冲液2.5 μL，25 mmol/L的MgCl22.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L的引物AB1、AB2、CSP1、CSP2各1 μL，1 UTaqDNA聚合酶，模板2 μL，RNase-free 水补充至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，30个循环：94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃后延伸5 min。

1.6 引物浓度优化 AB1、AB2和CSP1、CSP2引物浓度比分别采用1∶1，1∶1.5，1∶2，2∶1，1.5∶1，按照1.5的反应条件进行PCR反应。

1.7 PCR扩增灵敏度分析 将得到的阳性菌液抽提质粒，全自动波长读数仪测试质粒的浓度。10倍梯度稀释质粒至10-6，用1.5的PCR反应体系和反应条件进行扩增。

1.8 样品不同处理方式的比较 3种不同处理方式样品用1.5的PCR反应条件和反应体系进行扩增。

2 结果

2.1 样品检测结果 从2016年1月至2017年6月共采集了118份对虾样品，通过双重PCR检测出6份ANHPD核酸阳性。

图1 部分阳性样品的PCR结果图

1：空白对照； 2～7：阳性样品； 8：DL-2 000 Marker； M： DL-2 000 Marker

2.2 引物浓度优化结果 不同的AB1、AB2和CSP1、CSP2引物浓度都可以扩增出目标片段，AB1、AB2和CSP1、CSP2引物浓度比为2∶1,1.5∶1的时候产物电泳条带弱，浓度比为1∶1的时候电泳条带最强。

图2 引物浓度结果分析图

M： DL-2 000 Marker； 1：引物浓度比为1∶1； 2：引物浓度比1∶1.5；3： 引物浓度比1∶2； 4： 引物浓度比 2∶1； 5：引物浓度比1.5∶1

2.3 灵敏度分析结果 质粒浓度为23 ng/μL，质粒稀释到10-2之后未见电泳条带，因此10-2稀释梯度是检测的最低限。全自动波长读数仪测试这时候质粒的浓度为230 pg/μL。

图3 灵敏度电泳图

1： 未稀释的质粒； 2～7：10倍梯度稀释的质粒； 8：空白对照； M：DL-2 000 Marker

2.4 样品不同处理方式的结果 肝胰腺直接抽提的DNA双重PCR没有扩增出条带，菌液抽提DNA和肝胰腺培养液抽提DNA都能扩增出目标条带。

图4 样品不同处理方式抽提DNA的电泳图

M： DL-2 000 Marker； 1～6：肝胰腺培养液划板后抽提菌落DNA； 7～12：样品肝胰腺培养后抽提DNA

3 结论与讨论

本研究采用3种处理方式进行抽提样品DNA,一是肝胰腺组织直接抽提；二是肝胰腺培养液抽提，三是肝胰腺培养液划板后挑取的菌落培养后抽提DNA。结果发现，肝胰腺组织直接抽提的没有扩增出目标片段，肝胰腺培养液抽提和菌液抽提都能够扩增出目标片段。结合计算时间成本和试剂成本，建议实际检测过程中采用肝胰腺培养液抽提后进行PCR反应的步骤。

双重PCR反应关键之一在于反应条件的优化，尤其是引物浓度的优化。本试验设计了两对引物浓度比分别在1∶1，1∶1.5，1∶2，2∶1，1.5∶1，结果发现引物浓度比为1∶1时效果最佳。

目前采用分子手段对AHPND进行检测大部分是针对毒素PriA和PriB设计引物进行PCR检测[7-8]。分析ANHND序列，发现AHPND携带的特殊质粒上含有一段675 bp左右的冷休克蛋白(CSPs)，这些蛋白对细胞在低温时恢复生长和发挥细胞各种功能是非常重要的。本研究是设计了两对引物对冷休克蛋白和毒素PriA和PriB基因进行同时检测。目的是为了增强检测的特异性，减少假阳性的存在。

本研究建立了AHPND的双重PCR检测方法，并对广州机场口岸进境的草虾进行了监控，对AHPNS的监测和预防具有指导性意义。