IL-10对HepG2细胞凋亡的影响

叶 园 ， 童章隆 ， 张 宁 ， 殷伟丽 ， 王 琳 ， 李 妍

(1.吉林医药学院临床医学院 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林医药学院基础医学院 ， 吉林吉林132013)

原发性肝细胞癌(Primary Hepatic Carcinoma, PHC)是我国常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有78万新发病例，约74万死亡病例,其中我国约占45%,在癌症相关死亡率中仅次于肺癌，排名第二。且肝癌的发病率逐年增加，复发率高，预后不良[1]。目前，原发性肝癌最有效的治疗手段是手术，但因肿瘤大小、部位、患者肝功能情况及已发生转移等多种原因，往往无法进行手术治疗，只能选择介入治疗、放疗、化疗或综合治疗，但上述方法往往治疗效果欠佳，预后差，大多数国家原发性肝癌5年生存率仅为3%～5%[2-3]。 因此，找寻更为有效的肝癌治疗药物或方法，提高肝癌患者的生存率，一直是肝癌治疗研究的重要方向。研究表明，约有70%～90% 的原发性肝癌为肝细胞性肝癌[4]，人肝癌细胞HepG2 的组织来源为成肝细胞瘤，因此HepG2为国内外进行肝癌活性研究的经典细胞模型。

IL-10是一种多细胞源、多效性的细胞免疫抑制因子。本课题组前期研究已证实IL-10对HepG2细胞具有促进增殖的作用，本试验在前期实验的基础上进一步探讨IL-10对HepG2细胞凋亡水平的影响，以期进一步深入研究其促进HepG2细胞生长增殖的具体分子机制及找寻治疗原发性肝癌新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人肝癌HepG2细胞由吉林医药学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室朱文赫老师惠赠。

1.2 主要试剂 IL-10，购自美国PeproTech公司；DMEM高糖培养基，由美国Hyclone公司生产；胎牛血清，购自世纪元亨动物防疫技术有限公司；姬姆萨染液，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 主要仪器 细胞培养箱，购自北京东方安若生化科技有限公司； 超净台，由苏州净化仪器厂生产；倒置显微镜，日本奥林巴斯有限公司产品；MuseTM细胞分析仪，购自德国默克—密理博生物科技有限公司。

1.4 细胞培养 取出于-80 ℃冻存的HepG2细胞，迅速放入37 ℃的水浴锅中使其融化。细胞融化后移至超净台，将细胞悬液离心，加入含10%胎牛血清并含100 IU/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基，吸管吹打混匀后，移入培养瓶中，置入体积分数为5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，次日更换培养液后继续培养。细胞为贴壁生长，待细胞覆盖培养瓶底部80%后即可进行传代，试验取用对数生长期细胞。

1.5 MuseTM细胞分析仪检测HepG2细胞凋亡变化 取对数期HepG2细胞，接种于6孔板，放入培养箱中，37 ℃进行常规培养。24 h后添加含不同浓度IL-10的细胞培养液，继续培养24 h， IL-10的浓度分别为0(对照组)、10、20 ng/mL和 30 ng/mL。0.25%的胰酶消化，用完全培养液将每组细胞重悬成单细胞悬液，分别在1.5 mL离心管中每管加入100 μL细胞及100 μL MuseTMAnnexin V 试剂，轻轻混匀，室温避光孵育20 min。后用MuseTM细胞分析仪检测。

1.6 Hoechest33258染色检测HepG2细胞凋亡水平 将培养的对数期HepG2细胞胰酶消化后，制备成细胞混悬液，常规接种于24孔板。培养24 h后，添加含不同浓度IL-10的细胞培养液，继续培养24 h。吸出培养液，PBS洗两遍，给予4%多聚甲醛固定10 min后再用PBS冲洗两遍。各组加入Hoechest33258染液避光染色5 min，再次PBS冲洗，激光共聚焦显微镜观察并拍照，并计算每50个细胞中凋亡细胞数，每种浓度计数4组，每组至少重复计数3次以上。

1.7 姬姆萨染色观察HepG2细胞形态变化 各组HepG2细胞常规接种于24孔板，加药培养24 h后，弃上清，PBS 洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS再洗2 次，按照试剂盒说明书进行姬姆萨染色，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。计算每50个细胞中阳性细胞数，每种浓度计数4组，每组至少重复计数3次以上。

2 结果

2.1 MuseTM细胞分析仪检测HepG2细胞凋亡率 如图1所示，与对照组相比， 10，20 ng/mL和30 ng/mL IL-10处理细胞24 h后，均可引起HepG2早期凋亡细胞数和晚期凋亡细胞数减少，细胞存活率增加，且20 ng/mL和30 ng/ml IL-10作用更为明显。IL-10抑制细胞凋亡的作用具有剂量相关性，随着药物浓度的增加，细胞总凋亡数逐渐减少。

图1MuseTM细胞分析仪检测IL-10对HepG2细胞凋亡的影响

2.2 Hoechest 33258染色结果 Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。如中插彩版图2及图3所示，与对照组相比，IL-10组HepG2细胞Hoechst 33258染色阳性细胞数均减少，染色质凝集(亮蓝色荧光) 、碎片化和边缘化等典型凋亡细胞形态随药物浓度增加而缓解，与MuseTM细胞分析仪检测不同浓度给药组HepG2 细胞凋亡的结果相一致。

图3 不同浓度IL-10对HepG2细胞凋亡数目的影响

注：与对照组(0剂量组)比较 ； *：P<0.05

2.3 姬姆萨染色观察HepG2细胞形态变化 正常细胞的细胞核可被姬姆萨染液染为淡紫色均一状，而凋亡细胞呈现染色质固缩，呈紫蓝色深染。如中插彩版图4所示，在倒置显微镜下可见，正常细胞呈不规则状，胞质均匀。与对照组相比，随着IL-10浓度的升高，细胞数目明显增加，细胞间隙变小，凋亡细胞数目明显降低。

图5 不同浓度IL-10对HepG2细胞凋亡数目的影响

注：与对照组(0剂量组)比较 ； *：P<0.05

3 讨论

细胞因子是指来自肿瘤微环境中免疫细胞及肿瘤细胞的低分子量可溶性蛋白质，可通过多种方式参与肿瘤的演进及转归过程，发挥着协同或者拮抗效应[5]。IL-10作为一种多效性的生物因子，不仅具有免疫抑制作用，还具有免疫刺激的作用，但其主要的生物学活性为免疫抑制作用。IL-10可通过多种方式发挥免疫抑制功能，如通过抑制Th1细胞增殖及IFN-γ等细胞因子的合成，促进肿瘤细胞增殖，在机体抗炎及肿瘤免疫逃逸中起重要作用，促使肿瘤发生发展[6]。

有研究表明，在抗HBX抗体阳性的慢性乙型肝炎(Hepatitis B Virus，HBV)、肝硬化及原发性肝癌患者外周血中IL-10水平明显升高，其中重度慢性乙型肝炎患者血清中IL-10水平与慢性乙型肝炎病毒携带者和健康人相比均显著升高[7-9]，提示IL-10 与肝癌的发展存在一定的关系，但具体机制尚不明确。且IL-10在多种肿瘤组织中均呈现高表达。马旭[10]等研究证实，通过下调IL-10的水平可达到抗小鼠宫颈癌细胞增殖的作用。梁华刚[11-12]等研究发现，在肺癌患者的外周血中，IL-10的水平随肿瘤恶性程度及转移程度的增高而升高，在肺癌晚期患者的外周血中可检测到CD4+、CD5+与IL-10呈负相关，与IL-10的免疫抑制作用相一致。我们通过前期试验结果证实，一定浓度的IL-10能够明显促进肝癌HepG2细胞的增殖，且存在剂量依赖关系，但其机制尚不明确。

正常情况下，细胞增殖和细胞凋亡处于一种平衡状态。研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞增殖有关，而且与细胞的抗凋亡作用也密切相关。肝细胞癌的发生是一个多基因参与、多步骤和多阶段的复杂过程，其主要表现为细胞增殖和细胞凋亡调节的失衡[13]。细胞凋亡是细胞在基因调控下的自杀现象，在恶性肿瘤的发生发展过程中具有重要的生物学意义，目前多种药物主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡进而抑制肿瘤生长增殖。为了进一步确定IL-10是否对肝癌HepG2细胞凋亡和增殖具有双重调节作用，我们在前期试验的基础上，进一步探寻了IL-10对HepG2细胞凋亡水平的影响。

通过流式细胞术检测显示，IL-10可抑制细胞凋亡，且随着药物浓度增大，细胞凋亡率降低，活细胞数增加；Hoechest33258和姬姆萨染色均观察到，与对照组相比，加药组凋亡细胞数减少，细胞总数增多，细胞状态更好。提示IL-10促进HepG2细胞增殖的机制可能是通过抑制细胞的凋亡来实现的。接下来课题组将进一步研究IL-10抑制细胞凋亡的具体分子机制，以期为寻找肝癌的特异治疗靶点提供理论基础。