1株肉种鸭源金黄色葡萄球菌分离鉴定与药敏试验

申红春

(恩施职业技术学院 ， 湖北恩施445000)

葡萄球菌属于微球菌科中葡萄球菌属，该菌广泛分布在自然界中，可以引起鸡、鸭、鹅、火鸡、猪、兔等多种家禽、家畜发病，为临床中重要人兽共患病病原菌。鸭葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌引起鸭的一种急性或慢性传染病总称，该病可以感染不同品种、不同日龄的鸭，临床上主要表现急性败血症、关节炎、腱鞘炎、脚垫肿等，其中雏鸭最易感，主要表现急性败血症，死亡率较高，当育成鸭和种鸭感染后，一般呈慢性经过，主要表现关节炎、腱鞘炎、脚垫肿等症状，该病对种鸭危害较严重，成为引起种鸭死淘率较高的重要疾病之一。

2018年6月，恩施地区某肉种鸭规模化养殖场，12周龄的肉种鸭出现采食减少、精神沉郁、两翅下垂、缩颈，肉种鸭出现关节肿大，不敢站立，跛行或跳跃式步行，在出现症状3～5天后开始死亡，个别肉种鸭不表现任何的症状突然死亡。无菌采集死亡肉种鸭的肝脏、心血、关节渗出液等病料组织中分离到单一病原菌，被鉴定为金黄色葡萄球菌，因此，对从肉种鸭体内分离到金黄色葡萄球菌进行了致病性检测和药敏试验，为该病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2018年6月，恩施地区某肉种鸭规模化养殖场中死亡的12周龄的肉种鸭，无菌采集死亡肉种鸭的肝脏、心血、关节渗出液等病料组织。

1.2 主要试剂与仪器 药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；绵羊血培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、普通营养培养基、营养肉汤，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司； Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试纸条，购自Bio-Merieuxsa公司； DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；PCR仪由德国Eppendorf 公司生产；隔水式恒温培养箱由自上海一恒科技仪器有限公司生产。

1.3 试验动物 12周龄健康肉种鸭10只，由恩施地区某肉种鸭规模化养殖场提供，饲养于恩施职业技术学院实验动物中心。

1.4 分离与培养 无菌采集死亡肉种鸭的肝脏、心血、关节渗出液等病料组织划线接种于绵羊血培养基上，37 ℃培养12～18 h，挑取单个优势菌落接种于甘露醇氯化钠培养基上，37 ℃培养12～18 h。挑取单个菌落分别接种于普通培养进行纯化培养，并对纯化培养的分离菌株进行染色镜检。

1.5 生化鉴定 用比浊仪调整分离菌株菌液浓度为2个麦氏浊度，并接种于Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试纸条中，37 ℃恒温培养24～48 h，用ATB型自动化微生物生化鉴定系统测定分离菌株的生化特性。

1.6 16S rRNA PCR鉴定 利用水煮法提取分离菌株的基因组DNA，用细菌16S rRNA通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′(由华大基因生物工程公司合成)对分离菌株进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为50 μL：2×TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶检测分离菌株的目的条带， 将PCR产物送华大基因生物工程公司进行基因序列测序，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性比较。

1.7 致病性试验 取纯化培养的分离菌株接种于营养肉汤中培养至对数期后，用菌落计数法计数，调整菌液浓度为106CFU/mL。试验组每只腹腔注射0.5 mL(106CFU/mL)，对照组给予等量的生理盐水，试验组在攻毒12 h后，观察7 d，记录其发病情况和死亡情况。

1.8 药敏试验 参照美国美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断。

2 结果

2.1 细菌分离培养鉴定结果 分离菌株在绵羊血培养基上生长出边缘整齐的、圆形的、光滑的、带透明的溶血环菌落，呈现β溶血；在甘露醇氯化钠琼脂培养基上生长出圆形的、大小一致的、浅黄色或者米黄色的菌落；在普通培养基上生长出圆形的、白色的菌落，延长培养时间，白色的菌落变成金黄色的菌落；染色镜检可见单个短链和成堆的葡萄串状排列的阳性球菌。与报道的金黄色葡萄球菌的培养特性和形态学一致。

2.2 细菌生化鉴定结果 分离菌株V-P试验和过氧化氢酶试验阳性，靛基质试验阴性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，且产酸不产气；分解马尿酸盐、还原硝酸盐、精氨酸；不分解纤维二糖、阿拉伯糖、并水解淀粉、七叶苷，不产生H2S。ATB全自动生化鉴定系统中鉴定为金黄色葡萄球菌，评定合格率为99.9%。与报道的金黄色葡萄球菌的生化特性一致。

2.3 细菌16S rRNA PCR鉴定结果 分离菌株用细菌16S rRNA通用引物扩增出大约为1 492 bp左右的目的基因的条带(见图1)，分离菌株的PCR产物测序结果与GenBank中登录的参考株10株金黄色葡萄球菌参考株的基因序列同源性为在99.9%～100.0%之间，从分子生物水平证实了分离菌株为金黄色葡萄球菌。

2.4 致病性试验 试验组肉种鸭攻毒后的2～3 d，出现了精神沉郁、食欲减退、呆立，3只肉种鸭出现死亡，至到4 d，试验组的肉种鸭死亡率100%；剖检死亡的肉种鸭，从无菌采集病料组织中分离到金黄色葡萄球菌。对照组肉种鸭无明显的症状，因而证实了分离到金黄色葡萄球菌对肉种鸭具有很强的致病性。

图1 分离菌株16S rRNA PCR鉴定结果

M:DL-2 000 Marker ; 1～2:分离菌株

2.5 药敏试验 由表1可知，分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、环丙沙星、庆大霉素、氟苯尼考5种药物敏感；对氨苄西林、恩诺沙星、卡娜霉素、阿米卡星4种药物中敏；对青霉素、阿莫西林、强力霉素、林可霉素、大观霉素5种药物耐药。

表1 药敏试验结果

S：敏感，I：中敏，R：耐药

3 讨论

葡萄球菌根据脂溶性色素的生化反应可以分为腐生葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3类型，其中金黄色葡萄球菌是引起肉种鸭葡萄球菌病的主要病原菌，该病一年四季均可发生，在高温、多雨的季节或潮湿时节较为多发，其感染率和死亡率均较高，成为危害养鸭业主要细菌性疾病之一[1]。金黄色葡萄球菌可以分泌20多种毒性蛋白质，该菌的致病性与其分泌或者产生的毒素和侵袭性酶均有一定相关性，该菌可以引起化脓性疾病和毒素性疾病两类疾病[2]。金黄色葡萄球菌携带多种致病因子，α-溶血素主要毒力因子之一，可以产生毒素，并在金黄色葡萄球菌的致病和逃避机体免疫抑制过程中发挥重要的作用，β-溶血素是该菌的主要致病因子之一，具有溶解红细胞的特性，金黄色葡萄球菌溶血性与致病性密切相关[3]。近年来，关于鸭葡萄球菌病的发病呈现上升的趋势，应引起重视。

本试验从病死的肉种鸭体内分离到了1株金黄色色葡萄球菌，通过人工感染肉种鸭验证其致病性，结果表明，分离到的一株金黄色葡萄球菌对肉种鸭致死率为100%。从而证实了金黄色色葡萄球菌是引起肉种鸭发病的主要病原菌。金黄色葡萄球菌菌的主要通过创伤传播，也可通过消化道、呼吸道和脐带感染，其中病禽和带菌家禽是该病主要的传染源，当通风不良、拥挤、断喙、刺种疫苗、网刺等饲养管理不当也可以引起该病发生与流行。在肉种鸭养殖过程中引起注意[1,4]。由于金黄色色葡萄球菌抗原结构复杂，没有理想的疫苗，抗生素成为该病主要治疗手段。本试验药敏试验结果显示，分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、环丙沙星等5种药物敏感；对氨苄西林、恩诺沙星、卡娜霉素等4种药物中敏；对青霉素、阿莫西林、强力霉素等5种药物耐药。当肉种鸭发生该病时，应通过药敏试验选择敏感的药物，合理使用，提高治疗疗效，减少耐药性产生。同时加强平时的饲养管理，注意环境中消毒。