白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展

郭壮，赵慧君，雷敏，沈馨，蔡宏宇，张振东

（湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053）

白酒是中国特有的一种蒸馏酒，由于白酒的酿造工艺、生产环境以及酒曲制作方式的不同，形成了浓香型、酱香型、清香型、米香型等主要香型白酒，还由此衍生出兼香型等多种类型[1]。浓香型白酒以粮谷为主要原料，经传统固态法发酵，蒸馏，陈酿，勾兑而成，以己酸乙酯为主体复合香，是我国销量最大的白酒类型[2]。浓香型白酒使用泥窖发酵，窖池的优劣对浓香型白酒生产至关重要，以优质老窖养老糟才能生产好酒。上千年的驯化与自然选择，孕育了知名酒厂酒窖中独特的微生物区系，它们相互共生，相互竞争，通过复杂的相互作用关系，形成了一个稳定的生态群体。窖泥是白酒固体发酵过程中微生物的重要来源，是影响白酒的口感与品质的重要因素[3-4]。因此，对窖泥中微生物的研究意义重要性不言而喻。

近几十年来，科技不断进步，窖泥中的微生物研究技术手段也在不断推陈出新。首先是不依赖于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的传统的培养方法、磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）以及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等方法。然后是基于PCR的宏基因组研究策略如克隆文库，变形梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以及目前研究的主流-第二代测序技术，也是目前窖泥微生物研究的主要方法。本文将对浓香型白酒窖泥微生物研究中常用的技术方法进行介绍，并介绍它们在白酒窖泥微生物研究中的应用进展。

1 传统纯培养方法及其在窖泥微生物研究中的应用

纯培养技术是最早应用于微生物群落结构的研究手段，主要是使用不同营养成分的培养基对环境样品中微生物进行分离，然后根据微生物的菌落形态、生理生化来确定微生物的分类情况。后来引入了分子生物学方法后，对所分离的纯培养原核微生物的16S rDNA[5-6]基因和真菌微生物的26S rDNA或者转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）[7]间区序列对微生物进行分类，以此获取微生物的群落结构信息。

以纯培养方法对窖泥中的微生物研究由来已久。但是由于自然环境中仅有0.1%～10%微生物可以被培养分离，采用传统的纯培养方法容易导致目标环境中大量微生物无法培养而造成对样品中微生物多样性的低估。以岳元媛等的研究为例：采用厌氧培养方法对窖泥中的细菌进行了筛选分离，共得到8个属的细菌，分别是芽孢杆菌属、假单胞菌属、梭菌属等，绝大多数为兼性厌氧细菌，梭菌属细菌仅占1%左右[7]，这与采用未培养技术得到的结果大相径庭。

尽管传统纯培养技术具有许多局限性，但是该技术到现在仍在被广泛使用。这主要是由于该技术是研究特定种类的微生物生理生化特征，并将一些微生物应用于工业化的重要方法。科研人员也对传统纯培养技术进行了改进[8-9]：模拟自然环境，在分离海洋细菌时，使用海水配制培养基；改善培养条件，在培养厌氧细菌时，使用厌氧工作站；使用共培养技术，将共栖的两种或者数种微生物一起培养等等，但是仍然达不到未培养方法对样品中微生物多样性研究的效果，因此发展起来了多种不依赖于传统培养技术的方法。

目前采用传统纯培养技术对窖泥中的微生物研究，多集中在梭菌属。最初对白酒窖泥中的微生物研究发现，在这些复杂多样的微生物中，有一种呈鼓槌状的产芽孢杆菌（梭菌），能以乙醇、乙酸经丁酸合成己酸，这类微生物被称为己酸梭菌。1942年，该菌被命名为Clostridium kluyveri[10]。自从1964年己酸乙酯作为白酒中的香气成分被发现以来，己酸菌在白酒发酵过程中的作用逐渐被人们认识到，优质的己酸菌被发掘出来，如内蒙30、黑轻80等等，黑轻80己酸产量为约380 mg/100 mL[11]。学者对典型的浓香型白酒如泸州老窖[12]，五粮液酒业[13]，安徽金种子酒业[14]江苏汤沟酒业[15]等窖池窖泥中己酸菌进行了大量的研究工作，收集到了不少品质优良，己酸产量高的菌株，最高己酸产量可达4.36 g/L。己酸细菌是窖泥微生物的研究中最重要的发现之一，其含量是评估窖泥质量的基础。优质的己酸菌被用于退化窖池的养护[16-17]，还被用于生产人工窖泥[18]。使用己酸菌制作的人工窖泥在短期内就可生产出优质酒，打破了非50年老窖不能生产名酒的说法。

2 PLFA技术及其在窖泥微生物研究中的应用

泸州老窖是国内浓香型白酒的典型代表，保存有入选世界吉尼斯纪录，拥有400多年窖龄，国内最古老的白酒窖池。对窖泥微生物多样性报道最多的当属对泸州老窖酒业的窖泥研究，研究方法集中在了PLFA，克隆文库，聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（poly merase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）及第二代测序技术。

磷脂脂肪酸是生物细胞膜的主要成分，仅存在于活细胞膜中，当微生物死亡后，脂肪酸就会被代谢掉。细胞中包含脂肪酸的脂类物质主要有碳水化合物、脂性醇、磷脂、糖脂和中性脂等[19]。通常这些脂类物质在同一种微生物中是稳定的，并且操作难度与试验条件要求较低，因此PLFA指纹图谱技术被开发出来，在对窖泥、土壤、食品等多种环境的微生物的研究中得到应用[19-21]。Tunlid在1985年首次利用磷脂脂肪酸技术对油菜根际微生物的群落结构进行了研究，此后该技术逐渐被引入到其他的微生物研究领域。窖泥是一种特殊的土壤，因此在窖泥微生物的研究中也引入了磷脂脂肪酸技术。刘琨毅等[21]对窖泥微生物的分析表明，厌氧革兰氏阳性菌和真菌是窖泥中的优势菌群，不同窖龄窖泥中的微生物PLFA含量不同，300年窖龄中PLFA含量大于5年与100年窖龄[22]。但是另一研究报道了泸州老窖 20、50、100、200、300 年窖泥中革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌与需氧菌的比例并无显著差异[23]。

总体上来说，PLFA技术不依赖于分离和培养的技术，更为快速、简便，操作难度更低，但是磷脂脂肪酸分析方法不能对微生物在种或菌株水平上加以区分[25]，所以常与其他分析技术，如DGGE或传统培养方法相结合，用于的窖泥微生物研究。

3 克隆文库技术及其在窖泥微生物研究中的应用

克隆文库是20世纪末在对微生物多样性的研究中被开发出来。通过构建克降文库分析微生物群落时，首先要获得样品总DNA，以提取到的总DNA为模板PCR扩增微生物的16S rDNA基因，然后将得到的扩增产物与载体连接，转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序，根据测序结果判断样品中的微生物信息[25-27]。这一方法最早在1991年被Giovannoni等用来分析浮游细菌多样性[28]。由于克隆文库法针对原核微生物的16S rDNA全长，且避开了传统的纯培养方法，能将一些对营养要求苛刻的微生物鉴定出来，因此能更全面的反映样品中的微生物多样性；由于采用该方法能几乎获取微生物的16S rDNA全序列，所以结果也更加准确，被用于白酒窖泥微生物的研究。

2013年，刘森等[25]采集了四川一浓香型白酒公司20年窖池窖泥样品，从窖池上层窖泥中检测到Clostridium、Lactobacillus两个菌属，中层检测到5个菌属，分别是 Lactobacillus、Serratia、Clostridium、Bacillus、Caloramator，窖池下层检测到4个菌属，分别是Lactobacillus、Clostridium、Bacillus、Caloramator，发现窖池不同位置的微生物分布显著不同。在所有样品中，Clostridium与Lactobacillus菌属在各层样品中均占20%以上，为优势菌属。2014年[28]，同样采用克隆文库法对安徽金种子酒业的浓香型白酒窖泥微生物进行了解析，发现退化窖泥中优势菌门为Firmicutes与Bacteroidetes，而老窖泥中Firmicutes与Chloroflexi为优势菌门。尽管通过克隆文库法对窖泥的研究取得了一些成果，但是由于该法操作繁琐，且耗时耗力，因此已逐渐被DGGE与二代测序技术取代很少出现在近几年的研究报道中。

4 PCR-DGGE技术及其在窖泥微生物研究中的应用

DGGE技术能用于环境中细菌、蓝细菌、古菌、微微型真核生物、真生物和病毒群落的生物多样性的分析，目前主要研究对象是原核微生物及真菌微生物。原理是在聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）使聚丙烯酰胺凝胶从上到下呈现从小到大的变性梯度，PCR产物沿着化学梯度有不同解链行为，在凝胶的不同位置上停止迁移而分离开来[29]。PCR-DGGE分析微生物多样性的试验流程为：首先是样品总DNA的提取；然后以总DNA为模板进行PCR扩增；制作相应梯度的聚丙烯酰胺凝胶，然后在样品孔添加样品的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；对聚丙烯酰胺胶进行染色，挑取条带回收，克隆与测序，对聚丙烯酰胺胶进行分析[29-30]。

细菌16S rRNA基因含有多个可变区与保守区[5]（见图1）。

图1 细菌16S rRNA基因结构[5]Fig.1 The schema of ribosome complex and 16S rRNA gene

由于DGGE对大于500 bp的DNA片段分离度较差，通常使用16S rRNA基因中的一个或者两个区段。由于PCR-DGGE技术无需培养，检测快速，成本低，目前仍然与第二代测序技术成为当前白酒窖泥中微生物研究的主要技术。自从1993年，Muyzer[30]第一次将PCR-DGGE技术引入到微生物多样性的研究以后，该技术就在与微生物相关的各个领域得到广泛应用，在白酒窖泥微生物的研究也引入了PCR-DGGE技术（见表1），且成为白酒窖泥研究的主要研究方法。

2014年，Ding等[34]使用DGGE法对泸州老窖不同窖龄的人工窖泥中微生物进行了研究：共检测到2个细菌菌门，分别是Proteobacteria和Firmicutes，检测到9个菌科。样品中的主要微生物类群是Clostridiaceae，Lactobacillaceae。Clostridiaceae占到总微生物的46.2%；而Lachnospiraceae微生物仅在新窖泥中出现，而在3年与4年窖龄窖泥中消失，而Ruminococcaceae相反，在4年窖龄窖泥中出现，而在新窖泥中消失。2013年，Zheng等[23]对泸州老窖20年窖龄与300年窖龄窖泥的分析表明，20年窖泥主要类群为Lysinibacillus与Clostridium；300年窖泥主要类群为Lysinibacillus，Soilbacillus，Clostridium，不同窖龄窖泥中微生物存在显著差异。2015年，胡晓龙等[35]还专门针对窖泥中己酸梭菌16S rRNA基因序列的V4和V5可变区，设计了DGGE检测引物对（SJ-F和SJ-R），能特异性解析窖泥中梭菌菌群多样性，能灵敏且准确的对窖泥梭菌菌群组成及多样性进行研究。

虽然目前PCR-DGGE具有无需培养，且检测快速，成本低等一系列优势，是白酒窖泥微生物群落结构的主要研究方法，但仍具有一些缺陷[48]：仅能检出样品中含量超过1%的微生物，对一些含量低但可能具有重要功能微生物不能有效地检测；DGGE图谱中条带信息量低，可能会低估窖泥中优势微生物的多样性；PCR产物片段长度大于500 bp的序列不适用于该法，因此在以后可能会被高通量测序技术取代。

表1 白酒窖泥中微生物的研究方法Table 1 Research technique for study in microbiology in pit mud

5 第二代测序技术及其在窖泥微生物研究中的应用

1977年Sanger发明了双末端终止测序法，即第一代测序方法。测序技术不断革新，科研人员在一代测序技术的基础上，开发出的二代测序技术，即高通量测序法逐渐成为目前窖泥中微生物研究的重要手段，在传统发酵食品微生物中得到广泛的应用[49]。高通量测序技术的应用从2006年至今呈现明显的上升趋势。目前常用的二代测序平台主要是以Illumina公司的Solexa平台、ABI公司的SOLiD平台和Roche公司的454平台为代表[50-51]。二代测序测序的基本操作流程主要包括克隆文库制备、DNA片段固定、DNA片段单分子扩增、测序反应、光学图像采集与处理及序列拼接及组装[50]，具有：通量高（能得到0.035 Gb～1 800 Gb的数据信息）；准确率高；成本低；试验周期短；相比于传统可培养及其它分子手段，能检测到环境样品中稀有种属，即能全面客观地揭示目标环境中微生物群落信息，同时获得定性及相对定量信息等优势[50-51]，因此被广泛的应用于窖泥及其他样品中微生物的多样性研究。

2017年，Liu等[46]，同时采用DGGE与Illumina Mi-Seq二代测序技术分别对泸州老窖5年与100年窖泥中的真菌微生物进行了研究。DGGE法仅检测到了样品中12个菌属，而MiSeq法检测到检测到4个菌门（Ascomycota，Zygomycota，Basidiomycota，Chytridiomy －cota）与111个菌属，所获取的窖泥中的微生物信息量远大于DGGE法：泸州老窖5年与100年样品中检测到 Rhizopus，Aspergillus，Phoma等 19 个核心菌属，5 年窖龄窖泥优势菌属为 Rhizopus，Phoma，Trichosporoni；100年窖龄优势菌属为 Aspergillus，Candida。按照Yilmaz等的观点，自然界中绝大多数或者99%的微生物在实验室难以富集培养生长[52]，而DGGE由于技术本身的缺陷不能对低于1%的微生物类群进行表征，因此高通量测序法具有天然的优势。

酒窖窖泥环境比较特别，含有较高的乙醇量，较低的pH值及较低的氧气含量，窖泥中微生物群落结构复杂多样，对泸州老窖30年与300年窖龄的窖泥中细菌微生物进行了研究[53]：300年窖泥中古菌主要属于Euryarchaeota，占 8.8%～16.6%；30年窖泥中 Euryarchaeota仅占0.6%，含量远低于300年窖泥。在30年窖泥中，Firmicutes是优势菌门，占到92%以上，主要是乳酸菌Lactobacillus，占到90%以上；而300年窖泥中，Firmicutes也作为优势菌门，占到43%以上，主要是乳酸菌Lactobacillus，占到22%～41%，远远低于30年窖泥。而Clostridiales在300年窖泥中占到21%～40%，Clostridium 占到 2.6%～4.9%；Clostridiales在300年窖泥中占到约2.5%，Clostridium仅占到0.35%。可以看出，新老窖池窖泥中微生物群落结构存在显著差异。Hu等[45]对江苏汤沟浓香型白酒优质窖泥、普通窖泥与退化窖泥中细菌微生物进行了分析，发现在退化窖泥有中仅有 2个优势菌属：Lactobacillus，Ruminococcus；常规窖泥中有 Lactobacillus，Caloramator，Clostridium等12个优势菌属；而优质窖泥中有Lactobacillus，Caloramator，Clostridium等 15个优势菌属。随着窖泥质量的增加，检测到Lactobacillus含量显著减少，而 Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria及 Methanomicrobia 4个菌纲的核心属含量明显增加，表明这4个纲的微生物含量的增加及Lactobacillus含量减少有利于提高窖泥的质量。分析后认为，高乳酸含量、低NH4+、pH值、有机磷含量是导致窖泥退化的外因。

另外胡晓龙等[15]通过网络分析方法分析了微生物群落结构的相关性，从正相关网络图谱中获得了13个hubs，这些hubs与其他微生物间有着很强的相关联系，在这些微生物之间也存在协同作用，有利于窖泥环境中的碳、氮及硫元素循环及窖泥风味物质形成。从负相关网络图谱中共发现3个hubs包括Lactobacillus、Pediococcus和Streptococcus 3个属是典型的乳酸菌菌属，它们与多种微生物呈负相关关系。这也说明乳酸菌与其它窖泥微生物类群存在着一定的拮抗作用，能抑制其它微生物类群的生长繁殖。窖泥微生物类群之间存在着复杂相互作用关系，认识和解析窖泥中的微生物信息，将有助于人们采取措施有目的干预窖泥中的特定微生物，来提升白酒酒质与白酒生产效率。

虽然通过第二代测序方法比DGGE法获取的信息量更多，对窖泥中微生物的解析更为精细，但事实上二代测序技术并非无懈可击。由于测序读长所限大部分研究只能以16S rRNA可变区部分区段为扩增、测序靶点，致使对微生物分析鉴定只能停留在“属”水平，甚至“科”水平，不能对环境中微生物群落结构进行精准描述。

6 第三代测序技术简介

科研人员针对二代测序技术的不足，开发出第三代测序技术，包括Helicos Biosciences公司的单分子DNA 测序（true single molecular sequencing，tSMS）、Pacific Bioscience（PacBio）公司的单分子实时测序（single molecule real time sequencing，SMRT） 以 及 Oxford Nanopore的纳米孔单分子技术[54-55]。以PacBio SMRT测序技术为例，PacBio公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，核心是零模式波导技术（zero-mode waveguide technology，ZMW），以SMRT芯片为载体进行测序反应。ZMWs直径为100 nm，厚度为70 nm，刚好容纳一个DNA聚合酶分子，从而观察到DNA链合成过程。测序过程中，DNA聚合酶附着在ZMW孔底部，携带荧光标记的碱基，以单分子DNA为模板。在读取模板过程中，DNA聚合酶能结合不同碱基会发出不同颜色的信号，从而判别碱基种类[56-57]。

Mosher等[56]在2014年，使用PacBio SMRT测序技术对环境样品微生物多样性进行研究，认为SMRT技术比Roche/454测序技术精度要高。对16S rDNA基因V4区的测序表明，SMRT技术的错误率为Roche 454与MiSeq等二代测序平台的1/8[57]。使用SMRT技术对铁皮石斛和丹参基因组的研究，充分说明了SMRT技术的优越性，读长更长，且能免受DNA中高GC含量的影响，在对复杂基因组完整组装分析时，体现出了巨大的优越性[58]。此外，SMRT技术能识别DNA的甲基化，应用到DNA甲基化研究中。在对传统发酵食品如米酒曲[59]，泡菜[60]，乳制品与肠道微生物[61]的研究中也引入了SMRT三代测序技术，但尚未见到三代测序技术在白酒窖泥微生物研究中的任何报道。

7 宏基因组技术及其在窖泥微生物研究中的应用

宏基因组学也称为环境基因组学，元基因组学，生态基因组学。Handelsman等[62]于1998年第一次将宏基因组（metagenome）定义为‘the genomes of the total microbiota found in nature’，即环境中全部微生物群的所有遗传物质，以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以微生物多样性，种群结构，进化关系，功能活性，相互协作关系及与环境之间关系为研究目的的研究方法。与传统培养法及高通量测序技术相比，宏基因组测序分析有以下优点：无需培养微生物，能客观全面的还原菌群结构；测序周期短；测序通量大、灵敏度高，能对样品中总的微生物群落结构进行功能及代谢通路的分析[63-64]。

宏基因组技术的分析步骤为：首先提取环境样品DNA，经克隆转化、构建文库，最后上机测序。通过生物信息学分析，将下机后的原数据去除污染和接头序列、去除含N碱基序列、去除质量值小于20的序列、去除长度小于50 bp的短序列，获得的高质量序列进行序列拼接。获得的数据均进行两方面的分析：一方面进行物种分类学注释，分析种群分布，对不同生境下的种群进行比较分析；另一方面进行功能分析，首先将拼接好的Contigs进行开放阅读框预测，之后利用数据库进行功能注释和代谢通路分析。常用的功能注释数据库有 COG、KEGG、Nt、Nr、GO、Swiss-Prot、SEED等。常用的代谢通路数据库包括KEGG、RegulonDB、BioCyc、WikiPathwans、Reactome[64-66]等。

白酒固态发酵是一个复杂的过程，在窖泥中存在着大量难以培养的微生物，因此，通常对于菌群发酵机制及其相互作用知之甚少，而元基因组的方法不需要对菌株进行分离而直接测序，对窖泥微生物研究非常有效。2017年，Tao等[67]通过metagenomics法对绵竹市的浓香型白酒窖泥进行了研究，检测到了脂肪酸链延伸途径中的关键基因，重构了脂肪酸碳链延伸途径，该途径含有己酸合成途径的关键酶，表明窖泥微生物具有以乙醇或丙酮酸为底物合成己酸的能力。另外获取了窖泥微生物中甲烷合成途径中编码产氢酶与乙酸分解酶的基因，表明在甲烷菌与己酸菌之间存在氢转移作用，重构了基于Clostridium、ClostridialclusterIV、Methanoculleus与 Methanosarcins种间氢转移作用的己酸合成途径。另外根据分析结果，Clostridialcluster IV，Caloramator，Clostridium，Sedimentibacter，Bacteroides与 Porphyromonas 6个菌属构成了窖泥中己酸合成的活性微生物环境，Clostridialcluster IV与Clostridium能直接合成己酸。

8 展望

浓香型白酒采用泥窖发酵，在白酒糟醅发酵过程中，窖泥中的微生物逐渐进入到白酒糟醅中，窖泥来源的微生物约占到糟醅中总微生物的14%[47]，多数属于厌氧微生物。由于形成浓香型白酒主体香型物质己酸乙酯前体己酸的微生物多数属于厌氧梭菌[15]，窖泥微生物在白酒发生产中的重要性不言而喻。克隆文库、DGGE、第二代测序技术等分子生物学技术的发展，使人们对窖泥微生物多样性的认识上了一个新台阶，但并不能满足人们对白酒窖泥中微生物研究的要求。白酒窖泥环境，具有低pH值，高乙醇含量，低氧等特殊的特点，经过长时间的富集与驯化，蕴含了复杂的微生物类群。为进一步认识白酒窖泥间微生物在代谢上的联系，浓香型白酒以己酸乙酯为主体的复合香产生的微生物机制，对白酒香型物质产生具有重要贡献的微生物之间的生态关系，对白酒香气化学组分形成不利的微生物类群，新的科学技术的出现为白酒窖泥的这些科学问题的解决提供了可能。

鉴于第三代高通量测序技术的读长可以覆盖16S rRNA全长，测序精度高，不受高GC影响等一系列优点而越来越受到学者的青睐，同时宏基因组策略也在微生物群落代谢与功能中的研究中得到广泛应用。预计将来第三代测序技术与宏基因组在白酒窖泥中的应用会越来越多，将两者结合起来，将有助于人们加深对白酒固态发酵过程的认识，破解窖泥微生物群落中与白酒香型形成的基因代码与代谢机制，解决人们在白酒生产中的问题，以便更高效率的生产高品质的白酒。