虾、蟹壳中甲壳素/壳聚糖提取工艺及应用研究进展

孙翔宇，魏琦峰，任秀莲

（哈尔滨工业大学（威海）海洋科学与技术学院，山东威海264209）

甲壳素（chitin），又名几丁质，甲壳质，β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，分子式（C8H13NO5）n，是由β-1，4糖苷键[1]连接起来的线性高分子多糖[1-2]。甲壳素分布极为广泛，仅次于纤维素[3]，主要存在甲壳动物的外壳、昆虫表皮、菌类，软体动物内骨骼及藻类等微生物的细胞壁中，是自然界第二丰富的生物聚合物[4]。壳聚糖（chitosan），又称为脱乙酰甲壳素、甲壳胺，是甲壳素一定程度脱乙酰而得到的，化学名称是β-（1，4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。

甲壳素有3个主要特征：分子量、乙酰化度和结晶度。不同的特征出现在3种不同的晶体中：具有反平行排列的大分子α-甲壳素、平行排列的β-甲壳素和平行和反平行式的γ-甲壳素，其中α-甲壳素是最稳定且最丰富的一种形式[5]，在虾壳、蟹壳中有较强的层间和层间氢键作用；而β-甲壳素有弱分子间作用力的特点，相比于α-甲壳素，β-甲壳素对溶剂具有更高的反应活性和亲和力[6]。

甲壳素/壳聚糖是种带正电的天然高分子多聚糖[7]，对带负电荷的有害物质有吸附作用，能够清除人体内的“垃圾”。另外，由于其自身良好的成膜性、絮凝作用以及无毒无刺激等各种优异性能，在化工、纺织品以及食品、化妆品等行业有着广泛的应用[8-10]。

关于甲壳素/壳聚糖的制备，国内有很多相关的报道[11-13]，目前，国内外生产甲壳素的主要来源是水产加工后废弃的虾、蟹壳[14]。我国沿海水产资源丰富，加工后的废弃虾、蟹下脚料很多，若不合理加以利用，不仅是环境的负担，更是资源的浪费。因此，探索出一种经济、高效的方法来回收甲壳素，对于虾、蟹下脚料的综合利用具有重要的意义。

1 甲壳素/壳聚糖的提取工艺

我国目前工业生产甲壳素/壳聚糖的主要原料是水产加工厂废弃的虾蟹壳，虾蟹壳中含有大量的碳酸钙（20%～50%）和蛋白质（20%～40%）等[14]，所以提取甲壳素的关键就是去除其中的碳酸钙和蛋白质等主要物质[15]。目前甲壳素的提取方法主要有化学法、酶解法和微生物发酵法[16]，也有学者在不断地研发新的既简便又环保的绿色方法。

1.1 化学法

化学法又称酸碱法，是提取甲壳素的传统方法，也是当前工业实践的主要方法。其主要包括脱盐、脱蛋白和脱色3个步骤，操作简单，效率高，但要消耗大量的酸碱，并且会产生大量的酸碱废液，蛋白质、钙和虾青素等有效成分无法回收，既浪费资源也污染环境。随着人们的环保意识日益增强，也有越来越多的学者开始开发新的提取方法。蔚鑫鑫等[17]利用新鲜的小龙虾壳进行甲壳素提取，寻找出最佳提取条件：室温下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h后水洗至中性，然后在90℃～100℃用2.0 mol/L的NaOH处理4 h。在该条件下，甲壳素的提取率可达到16.52%，过高的NaOH浓度可能会导致甲壳素提取过程中固相萃取效率的降低。Chu Yong Soon等[18]研究了0.5 mol/L～2 mol/L NaOH处理的超虫幼虫中提取甲壳素，结果表明：使用0.5 mol/L NaOH处理后提取的甲壳素产量最高，达到5.43%。国外的Varun等[19]采用化学萃取法，从蟹壳废料中提取甲壳素，产率达到12.2%。Chun-Yung Huang等[20]采用挤压膨化（CP）、酸溶、碱沉相结合的方法，从阿根廷鱿鱼中提取壳聚糖，提高了甲壳素的脱乙酰度（deacetylation degree）、壳聚糖的提取率，降低了壳聚糖的分子量，增强了壳聚糖的杀菌活性。

1.2 酶解法

针对化学法的弊端，有关学者提出了资源化处理法，即采用生物酶对原料进行处理，越来越受到关注[21]。李永强[1]对去除灰分和蛋白以及甲壳素的制备进行了工艺优化研究，选用凝结芽孢杆菌作为发酵株，蛋白酶K将虾壳酶解，结果标明蛋白质与灰分的去除率可达93%和91%。岁姗姗[22]利用响应面分析法最终得到了有机酸结合蛋白酶法提取黄粉虫中甲壳素的最佳工艺条件，提取率可达（6.48±0.29）%，与传统工艺相比相差不大，说明改进传统工艺是有理论依据的。姜红鹰等[23]对几丁质酶、壳聚糖酶等的特性以及表达水平进行了总结，得出了毕氏酵母表达的壳聚糖酶可满足大规模制备的结论；国内外也有许多学者采用了酶法和化学法相结合的新思路来制备甲壳素，条件温和，不仅解决了污染的问题，对其中的蛋白与钙盐液进行了利用，但是该方法耗时长，脱蛋白的效果没有酸碱法好，商业化酶较贵，成本较化学法高[16，24]。

1.3 微生物发酵法

微生物发酵法就是利用一些细菌和真菌发酵体产生的有机酸或蛋白酶来去除蛋白质和钙盐，从而达到制取甲壳素的目的。湖北大学的黄璠[25]采用了微生物发酵法来脱钙、脱蛋白质，创新的先用了鼠李糖乳杆菌发酵虾壳，然后用枯草芽孢杆菌来发酵脱蛋白，脱蛋白率和脱钙率分别达到了85.45%和98.98%。

1.4 EDTA法

根据 pH13时EDTA-Ca的lgk′=lgk的特征，且EDTA的溶解度接近最大[26]的特点可用EDTA代替酸碱脱钙脱蛋白来达到制取甲壳素的目的，在此工艺中EDTA可循环利用，有效地降低了成本，减少了污染。窦勇等[27]采用此方法提取了淡水小龙虾头中的甲壳素，试验表明以13%的EDTA溶液作提取剂，在30℃、pH12、投料比 1 ∶15（g/mL）、反应 25 min 的条件下，提取效果最佳，提取率达24.05%，反应前后的脱钙和脱蛋白率分别达到了100.0%和98.6%；随后，在EDTA方法的基础上，窦勇等又采用了超声辅助的方法[28]，研究了淡水小龙虾烹饪前后的甲壳素提取情况，在超声频率60 kHz、功率180 W、超声反应45 min、处理温度30℃，EDTA 浓度 18%，pH 13、料液比 1∶24（g/mL）的最佳条件下，提取灰分含量为0.13%，含氮量为3.51%。孟凡欣等[29]采用了期望函数和响应面法优化了EDTA法提取虾壳中甲壳素的工艺：脱钙条件pH11，EDTA 浓度 11%，反应时间 2 h，料液比 1∶14（g/mL），10 g虾壳粉中平均可提出2.57 g（干重）甲壳素，相对于未优化的工艺提高了20.3%。

1.5 离子液体提取法

离子液体（ionic liquid，IL）由于其优质的性能备受瞩目，在2010年Qin Y等[30-31]首次提出了运用离子液体（IL）1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐（[C2mim][OAc]）提取甲壳素的方法。该方法是将甲壳素从甲壳素生物质中微波辅助溶解到IL中，随后通过加入水或另一种反溶剂凝结甲壳素。离子液体萃取的优点在于保留高分子量（molecular weight），并且有机会直接从萃取物形成纤维、珠粒和膜，以及由于IL的非挥发性而增加的安全性。主要缺点为需要大量的、昂贵的必须再循环的IL；Shamshina等[32]提出了由高酸性和碱性离子制成的廉价离子液体（IL），例如[NH3OH]-[OAc]，可以用于以相当甚至更高的几丁质产率和纯度浆虾壳。此外，[NH3OH]-[OAc]的生产成本相对较低，并且可在有效的制浆过程中反应性地脱盐和脱蛋白，从而能分离出纯度80%的结晶度高的天然几丁质。但是这里的缺点是直接使用NH2OH。反应性制浆允许比提取方法（2wt%）（wt%为质量百分比）高10倍的生物质负载量（20wt%），而不损害纯度（分别为78%和81%几丁质）。

1.6 预处理法

热甘油预处理法能够快速、高效地从虾壳中分离甲壳素：废虾壳在热甘油中的预处理能够通过脱水和温度诱导的碎片去除蛋白质，形成低分子量水溶性碎片，随后通过溶于水从壳基质中去除。Ramamoorthy等[33]开发了一种更绿色的方案：用热甘油预处理虾壳，随后用柠檬酸研磨，能够在一个步骤中除去蛋白质和矿物质。若进行两步处理，这种方法能够除去大量天然形式的矿物，且脱盐所需的柠檬酸的使用量减少80%，减少了释放的二氧化碳的量。此外，预处理过程中使用的甘油得到了有效的回收利用，光谱和热分析表明，此方法制取的甲壳素的质量优于常规化学法，而Lowry法定量分析表明此方法脱蛋白效率高于常规化学法。到目前为止，所有辅助处理都增强了几丁质的水解[34]，而M.Boric等[35]采用常压介质阻挡放电等离子体用作甲壳动物壳废物预处理过程的方法不需要任何溶剂，能够在强化蛋白质去除的同时而不影响甲壳素。

几种提取方法的优缺点比较见下表1。

表1 甲壳素提取方法优缺点比较Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of chitin extraction methods

通过上表中的比较，可以看出酶解法、微生物发酵法与离子液体法的产品质量较高，但成本较高，目前不适合工业上大批量生产；强化常压等离子体法还需要进一步考察能源消耗以及甲壳素产率与质量的问题；EDTA法和热甘油预处理法步骤简单，污染小，有着较好的发展前景，甚至可以取代酸碱法在工业生产上的地位。

2 甲壳素/壳聚糖应用研究

甲壳素/壳聚糖有着十分优异的生物活性，如果脱去甲壳素的乙酰基，它会转变成壳聚糖，即可溶性甲壳素。它们的结构与纤维素十分相似，这也意味着它们有些用途类似，甚至是更多的新用途。国内外的一些学者进行过研究，也证实了甲壳素及其衍生物有着增强免疫力、抗肿瘤、抑菌和止血等作用[36-37]，虾壳类水产养殖废弃物中壳聚糖的抗癌活性研究已被证明是一种良好的新型制药工业[38]。现将甲壳素/壳聚糖在医药、食品以及化妆品行业的应用作了介绍。

2.1 在医药方面的应用

2.1.1 手术缝合线

传统的手术缝线采用的是羊肠线，虽然吸收周期较短，但存在着降解副产品感染伤口等缺点[39]。壳聚糖有着止血功能[40]，能够促进伤口愈合，可将其制成手术缝合线[41]，在溶菌酶的作用下酶解，能被人体组织吸收，减少拆除手术线的疼痛以及伤口感染的可能性，有报道研究了甲壳素在大鼠肌肉降解周期大约为4个月，并且没有明显的炎症反应[42]。此外，甲壳素制成的手术合线在胆汁、尿液等液体中仍能保持强度[43]，是一种十分优秀的缝合线材料。

2.1.2 人造皮肤

甲壳素对人体细胞有很强的亲和能力，能被人体内的酶溶解，有着较好的成膜性及吸湿性等特点，被广泛的应用在医学材料领域。甲壳素能够很好的促进细胞再生，将其植入伤口处，便可生成人造皮肤[44-45]。1989年彭靖教授和医科大学的邓同兰教授合作，成功的将壳聚糖薄膜应用于人造皮肤的临床实验，并且1990年在国家级杂志发表了相关论文[46]。目前国外这类皮肤已经商品化，也应用到了整形外科手术中。

2.1.3 止血材料

合适的止血材料对术后恢复有着十分重要的作用，好的止血材料应该具备无毒、止血迅速和不增加感染率等特点。甲壳素及其衍生物有止血效果，它本身具有多糖大分子结构，骨架上带正电的氨基可与红细胞上的负电荷相互吸引，形成网状结构，最终形成牢固的血凝块[47]，从而达到止血的效果，是一种理想的止血材料。陈全等[48]研究了以甲壳素制备的温敏水凝胶对于大鼠肝脏损伤出血时的止血性效果，结果表明，其能够有效止血，并且在伤口愈合的过程中炎症较轻；刘缘等[49]对南极磷虾壳聚糖的止血效果做了研究，结果表明其明显优于其他商品化来源的壳聚糖，有十分广阔的应用前景。

2.1.4 药物控释载体

能作为药物载体需要具备两个条件：一是生物活性物质在其中必须稳定且按需释放；二是要有良好的机体舒适感和生物相容性。壳聚糖作为药物控释载体有着独特的优点：无毒、较好的生物相容性，酸性条件下可形成凝胶以及抗酸抗溃疡的活性，可有效地解决药物对肠道的副作用[50]。此外壳聚糖还可降低药物吸收前代谢，以及提高药物的生物利用度，是一种具有发展前景的材料。

2.2 在食品工业的应用

2.2.1 功能性食品

甲壳素和壳聚糖作为一种天然的生物质，无毒副作用，其本身就可以作为一种功能性保健食品。壳聚糖阳离子多糖和生物活性物质作为膳食纤维具有广阔的应用前景，近年研究表明，它在调节机体免疫功能，降血脂、血糖、血压，保护胃肠道等方面发挥着巨大的作用[51]。壳聚糖通过阻断膳食脂肪和胆固醇的吸收而具有降低胆固醇的能力，壳聚糖及其两种衍生物不仅具有较低的细胞毒性，而且可以控制营养，实现胰岛素抵抗治疗[52]。

2.2.2 食品添加剂

甲壳素的结构虽然与纤维素相似，但是它的吸湿性更优于纤维素，吸水后的表面活性降低程度也小于纤维素。作为食品添加剂，壳聚糖有增稠剂、被膜剂、澄清剂、抗氧化剂、风味改良剂、乳化剂等用途。壳聚糖做为被膜剂，被列入国家食品添加剂使用标准GB 2760[53]。

2.2.3 果汁澄清剂

我国目前大多用酶法或过滤法来澄清果汁，成本高且周期长。壳聚糖分子上存在游离的氨基带正电，能够和酸、多酚类的物质进行反应，进而对胶态颗粒絮凝沉淀，达到澄清果汁的效果，并且不会影响营养成分和风味。此外，用壳聚糖作澄清剂操作方便，成本低，有明显的经济效益[54-55]。

2.2.4 防腐保鲜

壳聚糖是真菌细胞壁的重要组成部分，具有很高的抗氧化活性，对几种食物中毒细菌和真菌具有优异的抗菌活性，被建议用作食品防腐剂[56]。研究表明，壳聚糖及其衍生物能延长食物的储存时间，其形成的抗菌涂层能够有效地延缓微生物入侵，从而使食物不易腐烂。此外，壳聚糖基可食性膜是可生物降解的，并且可以与包装中的产品一起食用[57]。

2.3 在化妆品行业的应用

壳聚糖是亲水胶体，可以与蛋白质等相互作用形成保护膜，从而起到保湿的作用。能够在头发表面形成一层覆盖膜，不易沾染灰尘，是一种理想的固发原料[58]。国外有学者将甲壳素用作化妆品的活性载体，甲壳素-纳米纤维（chitin nanofiber）被嵌入抗氧化剂成分（褪黑激素、叶黄素和胞外蛋白），通过皮肤层的渗透可改善活性成分。几丁质和抗氧化成分的结合具有清除自由基的作用，可用于防止太阳辐射对光老化和皱纹的有害影响[57]。

3 展望

甲壳素是全球第二丰富的生物聚合物，是重要的功能分子，具有十分优异的生理活性，有着保护消化系统预防与治疗高血压等许多功效，市场需求量也越来越大，一种简便且环保的分离方法成为一种迫切的挑战。目前，操作简便、成本较低的传统酸碱法仍然占据着工业生产的主要地位，但环境污染问题着实严重，应打破这种格局，实现绿色环保的生产模式。微生物发酵法存在着发展空间，应着力解决大批量生产时，酸与蛋白酶产生量不足的问题，以期实现工业化；此外，EDTA法和热甘油预处理法值得发展，适合长期的大批量生产，尤其热甘油预处理法有望成为代替酸碱法成为工业生产的支柱。

每年有大量的海产品下脚料被丢弃，这些是甲壳素的重要来源。我国水产资源丰富，尤其是沿海地区，若能将其加以利用，不仅减少了资源的浪费，也减轻环境的压力。虽然甲壳素的利用在近几年有了一定的进展，但远远不够，应继续加大研究力度，使之产业化，为我国的经济效益做出贡献。