大果山楂酵素发酵过程中组分及抗氧化性研究

张巧，陈春喜，陈振林，周锦菊，段振华，*

（1.贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州542899；2.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；3.广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地，广西贺州542899）

大果山楂是一种药食兼用的水果，在广西很多地区均有种植。与普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工与储藏，鲜食味道好且营养丰富，其品质在全国目前已知的山楂品种中也名列前茅[1-2]。因为大果山楂口感酸甜又有理气健脾、消食导滞的功能，市场上出现不少以大果山楂为原料的产品，大多是经初步加工的产品，如山楂饼、山楂糕、山楂饮料等。但目前市场及学术研究中，山楂发酵制品仅限于酒和醋，对于山楂酵素这种重要的生物发酵制品，鲜有报道。酵素是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种微生物复合发酵水果、蔬菜而成的，具有较高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及超氧化物歧化酶活性的一类生物发酵制品，因此酵素也称为酶[3]。酵素在多种微生物的作用下，不仅保存了果蔬原有的营养成分，还能形成一些新的活性成分，增强其营养和保健价值[4]。这些丰富的营养物质使得酵素具有消炎抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保护肝脏等功效[5-8]。林琳等以人参，灵芝等滋补品开发的天然酵素，已被证实具有抗肿瘤和调节免疫力的作用[9]。

酵素在我国的研究起步较晚，天然酵素的开发和利用目前还位于初步水平，而且功能成分含量并不高，往往无法达到媒体宣传的作用。近年来我国学者开始重视酵素食品的研究，并已取得一些进展。但与先进国家还存在不少差异，日美等国对酵素食品的研究和开发十分重视，市面上酵素产品已经商业化，利用酵素产品来加工生产酵素食品也已经市场化，但我国还未实现酵素食品商业化，因此需要加快对酵素产品的研究。本研究对大果山楂酵素发酵过程中的某些组分及抗氧化活性的变化规律进行探究，为大果山楂酵素产品的生产和开发提供一定的技术支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大果山楂，贺州水果建材市场购买；福林酚试剂（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；碳酸钠、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸钠、重络酸钾等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722N可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；高速冷冻离心机：Eppendorf公司；恒温水浴锅：上海宜昌仪器纱筛厂；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 大果山楂酵素的制备工艺

大果山楂→洗净→沥干→切块→热烫→消毒→加糖→自然发酵→灭菌→酵素

操作要点：将新鲜的大果山楂洗净后沥干，切成4块，去核去梗，沸水中加热2 min后立即置于冷水冷却至常温。山楂块与红糖经紫外处理45 min进行消毒，发酵罐经高压杀菌（121℃，15 min）使其无菌。将消毒后的山楂装入发酵罐，在其上中层分别加入山楂果肉25%（质量分数）的红糖，密封。发酵罐置于暗处，室温（25±1）℃进行自然发酵，发酵期间定期放气。在发酵第 5、10、15、20、25、30、40、55 天分别取得酵素样液，离心（10 000 r/min，10 min），上清待测。

1.4 pH值的测定

取不同发酵天数的酵素样品上清液5 mL于试管中，采用pH计测定其pH值。

1.5 总糖的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法测定总糖的含量并稍作修改[10]，具体操作为：取1 mL稀释样液，加入4 mL 6 mol/L的HCl，沸水加热15 min，冷却后用6 mol/L氢氧化钠溶液中和，蒸馏水定容至100 mL。取水解后的样液，加入DNS试剂，沸水浴反应后测定其540 nm处的吸光值。采用0～1 mg/mL的葡萄糖溶液制备标准曲线，得线性回归方程为：y=0.817x-0.012，R2=0.996。根据回归方程和样液的吸光值，测定样液中总糖（以葡萄糖计）的含量。

1.6 酒精度的测定

采用比色法测定样液中的酒精度并稍作修改[11]。具体操作为：取5 mL的稀释样液至试管中，加入1 mL 2%重络酸钾溶液，5mL浓硫酸，摇匀，沸水加热10min，冷却后测定600 nm下的吸光值。采用0%～0.2%（体积分数）的乙醇溶液制备标准曲线，得线性回归方程为：y=2.588x-0.006，R2=0.998。根据回归方程和样液的吸光值，计算各个样液的酒精度。

1.7 总酚的测定

总酚含量的测定参照徐辉艳的福林-酚法并稍作修改[12]。采用0～0.02 mg/mL的没食子酸溶液制备总酚的标准曲线，得线性回归方程为：y=1.622x-0.009，R2=0.999。根据没食子酸的线性回归方程和样液的吸光值，测定各个样液的总酚含量。

1.8 还原力的测定

还原力的测定参照Yildirim等的方法并稍作修改[13]。以蒸馏水调零，测定各个样品在700 nm处的吸光值，还原力与吸光值大小成正比。

1.9 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除率的测定参照Blois等的方法[14]。具体操作为：将一定量的稀释样液与2×10-4mol/L的DPPH溶液（80%乙醇配制）等体积混合，室温条件下静置30 min，以蒸馏水调零，测定各个样品在517 nm时的吸光值。DPPH自由基清除率由公式（1）计算而得。

式中：A1为DPPH溶液与样品稀释液的吸光值；A2为样品稀释液和80%乙醇的吸光值；A0为DPPH溶液和蒸馏水的吸光值。

1.10 羟基自由基清除能力的测定

羟基自由基清除率的测定参照Liu等[15]的方法。具体操作为：在一定量的待测样液中，依次加入双氧水、水杨酸钠和硫酸亚铁，混匀，37℃恒温水浴1 h，以蒸馏水调零，测定562 nm处的吸光值。羟基自由基清除率由公式（2）计算而得。

式中：a1为不加样品的吸光值；a2为加样品的吸光值。

2 结果与分析

2.1 大果山楂酵素发酵过程中pH值的变化

大果山楂酵素发酵过程中pH值的变化能反应产酸情况以及发酵是否正常。pH值随发酵时间的变化情况见图1所示。

图1 大果山楂酵素发酵过程中pH值的变化Fig.1 Changes in pH during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由图1可知，发酵前30天，大果山楂酵素液的pH值在 3.14～3.37 范围内变化，发酵 5 d～10 d 下降，10 d～20 d上升，20 d～30 d再下降，30天后pH值趋于稳定。在发酵5 d～10 d，发酵瓶内产生大量气泡，这是微生物的生长和代谢产生了大量的二氧化碳。由于二氧化碳气泡在发酵瓶内不稳定，使得酵素液的pH值上下浮动。30 d后进入慢速发酵阶段，pH值趋于稳定。

2.2 大果山楂酵素发酵过程中总糖含量的变化

红糖是大果山楂酵素的主要原料之一，作为酵素液中微生物的重要碳源，总糖含量的变化是反应酵素液中微生物活动情况的指标之一[16]。大果山楂酵素发酵过程中总糖含量的变化情况见图2所示。

图2 大果山楂酵素发酵过程中总糖含量的变化Fig.2 Changes in tatal sugar content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由图2可知，随着发酵时间的延长，大果山楂酵素的总糖含量在发酵刚开始的前15天有明显的上升，达到1.0 g/mL以上，这是由于酵素制备时红糖采用分层添加的方式，发酵初期，上层的红糖还未完全渗入溶液中，随发酵时间增加，酵素液的总糖含量会有所提高。发酵25天后，由于微生物的消耗利用，糖含量迅速下降。发酵40天后的总糖含量缓慢减少，这是由于微生物活动降低，糖消耗量减少。发酵55 d时的总糖含量低于0.06 g/mL。

2.3 大果山楂发酵过程中酒精度的变化

大果山楂果肉及红糖只经过了紫外消毒，而没有进行灭菌，因此山楂果肉及红糖中仍存留某些微生物，如酵母菌、醋酸菌等。酵母菌在发酵过程中会利用糖生成乙醇，而醋酸菌能利用乙醇产生醋酸，且乙醇含量影响发酵饮料的口感，因此发酵过程中乙醇的变化是一个重要的指标之一。大果山楂酵素发酵过程中酒精度的变化情况见图3所示。

由图3可知，在发酵前20天内，酵母菌生长代谢较快，产生大量的乙醇，酵素的酒精度含量在这段时间范围内持续增加，在20 d达到最高18.21%vol，之后开始不断下降。

2.4 大果山楂酵素发酵过程中总酚含量的变化

酚类物质是大果山楂的主要活性成分，大果山楂酵素发酵过程中总酚含量的变化情况见图4所示。

图3 大果山楂酵素发酵过程中酒精度的变化Fig.3 Changes in alcohol content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

图4 大果山楂酵素发酵过程中总酚含量的变化Fig.4 Changes in tatal phenols during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由图4可以看出，大果山楂酵素总酚含量随着发酵时间的增加呈现出先上升后下降的。发酵20 d内，酵素的总酚含量迅速增加，从1.72 mg/mL上升至最大值7.61 mg/mL；20 d～40 d大果山楂酵素中总酚含量开始持续下降；40 d后，总酚含量无明显变化，稳定在2 mg/mL左右。发酵过程中总酚含量的增加与多因素有关，可能原因是发酵过程中部分酚类物质的持续溶出，也可能是一些大分子酚类物质被微生物利用生成小分子酚类物质，使总酚含量增加[17-18]。然而，发酵20d后，较多的酚类物质被不断氧化和降解，造成其含量的下降。

2.5 大果山楂酵素发酵过程中还原力的变化

大果山楂中的多酚、黄酮类物质使其具有较强的抗氧化活性[19]，大果山楂酵素发酵过程中还原力的变化情况见图5所示。

由图5可知，还原力随着发酵时间的增加呈现出先上升后下降的变化趋势，发酵到25 d时的还原力吸光值最高5.082（即还原力最强），25 d后开始下降。还原力的变化趋势与多酚含量具有一定的相关性[20]。

2.6 大果山楂酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化

DPPH自由基常用于评价物质的抗氧化活性，大果山楂酵素发酵过程中的DPPH自由基清除率的变化情况见图6所示。

图5 大果山楂酵素发酵过程中还原力的变化Fig.5 Changes in reducing capacity during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

图6 大果山楂酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化Fig.6 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

DPPH自由基清除能力被广泛地应用在评价短时间内的抗氧化活性[21]。由图6可知，大果山楂酵素的DPPH自由基清除率随着发酵时间的增加呈现出先上升后下降的变化趋势；前20天内持续上升直至最高84.11%，20 d之后一直下降，发酵55 d时，DPPH清除率比发酵5 d提高了19.16%。蒋增良研究的葡萄酵素在天然发酵过程中的DPPH自由基清除率增加了12.5%[22]。酚类物质的增加很有可能是DPPH自由基清除能力提高的重要原因。

2.7 大果山楂酵素发酵过程中羟基自由基清除率的变化

大果山楂酵素发酵过程中的羟基自由基清除率的变化情况见图7所示。

由图7可知，大果山楂酵素的羟基自由基清除率也随着发酵时间的增加呈先上升后下降的变化趋势，在前15天内一直上升，且在第15 d至最大值59.57%，之后开始缓慢下降至51.66%左右稳定，发酵第55天，羟基自由基清除率提高了13.36%。

图7 大果山楂酵素发酵过程中羟基自由基清除率的变化Fig.7 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

3 结论

研究发现，大果山楂酵素发酵过程中，发酵30 d内的pH值在3.14～3.37范围内变化，30 d后pH值稳定在3.15。总糖含量、酒精度、总酚含量、还原力、DPPH和羟基自由基清除率均呈先升高后降低的趋势。总糖含量在发酵20 d达到最大值1.05 g/mL，55 d后的总糖低于0.06 g/mL；发酵20 d时的酒精度达到最高18.21%vol，总酚含量最大值7.61 mg/mL；发酵25 d时还原力最高；此外，发酵55 d时的DPPH、羟基自由基清除率分别提高了19.16%、13.36%，大果山楂酵素自然发酵至15d～25 d时，其抗氧化能力最强。对大果山楂酵素发酵制备过程中的主要组分及抗氧化活性变化规律进行探究，有利于确定合适的发酵周期，为大果山楂酵素产品的生产和开发提供一定的理论依据和技术指导。