酸杨桃发酵液抑菌活性及稳定性研究

戴梓茹，农月睿，黄巧，张晨晓，李莹，覃桢杰

（1.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西钦州535011；2.钦州学院食品工程学院，广西钦州535011）

酸杨桃是杨桃的一种，偏酸味，种植于热带亚热带地区，四季带果，产量大，营养丰富，具有生津止渴、保肝、降糖等功用[1-4]。目前对于杨桃的研究和加工多是甜味品种的杨桃，包括果树培育、保鲜、果汁加工等[5-10]。而酸杨桃味道较酸，人们甚少鲜食。酸杨桃发酵液是两广地区人们用盐制浸泡自然发酵的方法制备的传统地方性日用饮料，对肠胃热、咽喉痛、牙痛、消炎降火等具有特别的调理功效，浸泡后的果实可用作烹调调味料、日常小零食等。由于酸杨桃发酵液口感偏酸咸，其特殊功效缺乏科学数据支持，致使酸杨桃发酵饮料难以推广。本研究采用牛津杯法测定了酸杨桃发酵液对李斯特菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌5种供试菌的抑菌活性，同时以原液稀释液为样本，确定其最小抑菌浓度，并对酸杨桃发酵液中的抑菌活性物质进行了初步研究，为酸杨桃的精深加工和产品推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸杨桃：采集于广西博白；氢氧化钠（分析纯）：江西景泰设备有限公司；盐酸（分析纯）：成都市科龙化工股份有限公司；氯化钠（分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；营养琼脂（生物试剂）、细菌学蛋白胨（生物试剂）、牛肉浸膏（生物试剂）、琼脂粉（生物试剂）：山东梁山科鑫生物制品有限公司；胰蛋白酶（5 000 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、碱性蛋白酶（50 000 U/g）：南宁市东恒华道生物科技有限公司；李斯特菌（G+）、大肠杆菌（G-）、大肠杆菌 O157（G-）、金黄色葡萄球菌（G+）、蜡样芽孢杆菌（G+）：由钦州学院北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室提供。

1.2 仪器与设备

HH-S2数显恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；SO510C立式压力蒸汽灭菌器：重庆雅马拓科技有限公司；BCD-575WDBI立式冰箱：青岛海尔股份有限公司；Medium超纯水机：上海和泰仪器有限公司；LHS-150HC-II恒温恒湿箱：上海一恒科学仪器有限公司；C20-HK2002E多功能电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；GZX-DH.500-BS型电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；B型玻璃仪器气流烘干器：巩义市予华仪器有限责任公司；ME204E/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3EpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 酸杨桃发酵液制备

1）样品准备：按照比例（960 mL无菌水，400 g酸杨桃，50 g食盐）将各种原材料及配料加入灭菌的发酵罐中，发酵3周，将酸杨桃发酵液取出，过滤，得到酸杨桃发酵液原液，并用无菌水稀释成不同的浓度梯度，冷藏于无菌离心管中，备用。

2）食盐水对照：按比例（960 mL无菌水，50 g食盐）保存3周后，其余操作同（1），获得5%食盐水对照。

1.4 酸杨桃发酵液抑菌活性研究

1.4.1 菌种活化及菌液制备

1.4.1.1 培养基

营养肉汤：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

营养琼脂：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2～7.4，琼脂 17 g。

2%水琼脂：20 g琼脂粉加入1 000 mL水中，加热溶化后，于121℃灭菌15 min。

1.4.1.2 菌液制备

菌种传代培养：取适量菌种，接种到试管固体斜面培养基中，置于37℃培养24 h，室温放置4 h，置于4℃冰箱保存。

供试菌菌悬液制备：挑取单一菌落接种到液体培养基中于37℃培养12 h，以1%的接种量传代培养一次后，用生理盐水（0.85%）进行10倍梯度稀释，选取10-3倍稀释液为试验用的菌悬液。

1.4.2 酸杨桃发酵液抑菌试验

选取牛津杯法测定酸杨桃发酵液抑菌活性。在平板中加入10 mL水琼脂，待其凝固后，用镊子将灭菌后的牛津杯置于素琼脂上（每个平板可放置4个牛津杯）。将灭菌后的营养琼脂冷却到40℃，以2%的接种量加入菌悬液，混匀后倒约25 mL于水琼脂层上（注意不要倒入牛津杯小孔中），待其凝固后，在一个牛津杯小孔中加入0.2 mL的对照溶液（无菌水或5%食盐水），其余3个牛津杯小孔中加入0.2 mL的酸杨桃发酵液样品。在37℃下正置培养24 h后，观察是否有抑菌圈出现，若出现抑菌圈，再用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.5 酸杨桃发酵液抑菌稳定性研究

1.5.1 pH值对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响

测定得知酸杨桃发酵液pH值为1.8，按照步骤配制以下溶液：1）配制与酸杨桃发酵液pH值相同的盐酸溶液25mL；2）分别取10mL的酸杨桃发酵液于50mL的烧杯中，向烧杯加入氢氧化钠溶液调节pH值为3、4、5、6、7。将以上溶液与酸杨桃发酵液原液作为试验组，以浓度为5%的食盐水作为对照组进行试验，探讨pH值对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响。

1.5.2 温度对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响

取3支试管分别加入10 mL酸杨桃发酵液，将3支试管分别置于40、60、100℃的水浴锅中水浴加热1 h～4 h。将3个温度处理的盐制酸杨桃溶液作为试验组，未经处理的酸杨桃发酵液原溶液作为空白对照进行抑菌试验。

1.5.3 酶处理对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响

取3个250 mL的烧杯分别向其中加入100 mL的酸杨桃发酵液溶液，再分别向3个烧杯中加入杨桃水质量0.1%～0.2%的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶3种酶液，然后将3个烧杯置于50℃的水浴锅中水浴加热4 h，95℃下水浴加热灭酶15 min。将处理过的样本作为试验组，未经处理的酸杨桃发酵液原溶液作为空白对照进行抑菌试验。

2 结果与分析

2.1 酸杨桃发酵液对5种供试菌的抑菌活性

酸杨桃发酵液对5种指示菌的抑制作用及其最小抑菌浓度结果见表1。

表1 酸杨桃发酵液对5种供试菌的抑菌活性Table 1 Bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid with five bacteria

由表1可知，酸杨桃发酵液对李斯特菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌均有良好的抑菌作用，抑菌圈直径分别达到20.06、23.79、25.19、22.21、21.66 mm，最小抑菌浓度分别为 9、15、15、12、12 倍原液稀释液。

2.2 pH值对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响

测定得知酸杨桃发酵液原液的pH值为1.8。试验选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌，以浓度为5%的食盐水和与pH值为1.8的盐酸作为对照，依次测定pH值调至3、4、5、6、7的酸杨桃发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用，结果见表2。

由表2可知，随着pH值的升高，酸杨桃发酵液抑菌效果逐渐降低，当pH≥6时，抑菌作用消失。浓度为5%的食盐水及pH值为6的酸杨桃汁两者没有抑菌作用。pH1.8的盐酸对两种指示菌具有抑制作用，但其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为12.77、12.30 mm，明显小于酸杨桃发酵液抑菌圈直径。因此，可知酸杨桃发酵液在较强酸性环境中的抑菌效果较好，碱性条件下，抑菌作用逐渐减弱甚至抑菌活性消失，这与雪松松针提取物、甜叶菊废渣提取物的抑菌稳定性研究结果一致[11-12]，分析原因，可能是碱性环境导致酸杨桃发酵液的抑菌活性物质结构发生变化，从而使抑菌效果减弱或消失。

表2 pH值对酸杨桃发酵液抑菌活性的影响Table 2 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by pH

2.3 温度处理对酸杨桃发酵液抑菌效果的影响

以大肠杆菌为指示菌，酸杨桃发酵液原液为对照，置于40、60、100℃水浴处理1 h～4 h的酸杨桃发酵液为试验样本，检测其抑菌效果，结果见表3。

表3 温度处理对酸杨桃发酵液抑菌效果的影响Table 3 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by temperature

由表3可知，不同处理温度和不同处理时间处理过的酸杨桃发酵液之间抑菌作用没有显著变化，且与酸杨桃汁发酵液原液的抑菌效果无显著性差异。因此，可以推断酸杨桃发酵液的抑菌活性物质具有良好的耐热性。

2.4 酶处理对酸杨桃发酵液抑菌效果的影响

以大肠杆菌为指示菌，酸杨桃发酵液原液为对照，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶处理的酸杨桃发酵液为试验样本，检测其抑菌活性，结果见图1。

图1 酶处理对酸杨桃发酵液抑菌效果的影响Fig.1 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by enzyme

如图1所示，3种蛋白酶处理后，抑菌圈直径分别为23.17、23.88、23.53 mm，酶处理后的酸杨桃发酵液抑菌活性与酸杨桃发酵原液的抑菌活性无显著差异，由此可推断，酸杨桃发酵液中的抑菌活性物质是非蛋白类物质。

3 结论

本文采用牛津杯法测定了酸杨桃发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌活性，同时确定了对不同指示菌的最小抑菌浓度，并通过研究pH值、温度以及酶处理对抑菌活性的影响，初步确定了酸杨桃发酵液中抑菌活性物质的特性。研究表明酸杨桃发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌都有良好的抑菌活性，抑菌圈直径分别为 20.06、23.49、25.19、22.50、21.56 mm，最小抑菌浓度分别为酸杨桃发酵液原液9倍～15倍稀释液。酸杨桃发酵液随pH值升高，抑菌活性逐渐降低，当pH＞6时抑菌活性消失，温度及蛋白酶对酸杨桃发酵液的抑菌效果没有显著影响，可以推断酸杨桃发酵液中的抑菌活性物质可能是一类耐高温的非蛋白类的酸性物质。因此，将酸杨桃发酵液作为酸性环境下的具有良好耐热性的非蛋白类天然防腐剂具有广阔的前景。本研究主要对酸杨桃发酵液的抑菌作用及抑菌性质作了部分基础性的研究，研究工作还不够透彻和全面，还存在一些尚待改进的工作。后续研究可对酸杨桃发酵液中的抑菌成分进行分离鉴定，并通过体内动物实验进一步阐明其抑菌机制，为酸杨桃多功能开发利用提供科学依据。