抗菌肽与喹乙醇体外抑菌效果的比较及对断奶仔猪生产性能的影响

张 江， 刘扬科， 张俊辉， 张 琳， 巢麟锋， 熊海涛

（1.北京中农颖泰生物技术有限公司，北京100193；2.中国农业大学动物科技学院，北京100193；3.林州中农颖泰生物肽有限公司，农业部饲用抗生素替代技术重点实验室，河南林州456550；4.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070）

喹乙醇属于喹噁啉类抗生素，对于缓减仔猪断奶腹泻，促进生长具有明显的作用。然而，喹乙醇具有明显的蓄积毒性，长期超量添加，存在潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌。根据农业部2017年12月6日《关于停止喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂用于食品动物的公告》，2019年5月1日停止喹乙醇用于食品动物。故寻找喹乙醇的替代方案具有重要的理论和实际意义。目前，作为潜在的抗生素替代品，抗菌肽、微生态、酶制剂、植物提取物成为现阶段重要的研究对象。

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，广泛地存在于生物界，其是机体先天免疫系统的重要成分，构成宿主防御病原微生物入侵的第一道屏障（魏艳彬，2009；Haug，2007）。 肠杆菌肽是在肠道微生物发现的一种抗菌肽（RauL，1992），其具有很强的抑制大肠杆菌和沙门氏菌的作用（Maria，2001）。肠杆菌肽是由21个氨基酸组成的套索肽，分子质量为2.1 kDa，其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构，9～21氨基酸形成β发夹结构，贯穿圆环，故其性质非常稳定，对高温、蛋白酶有良好耐受性（Marvin，2003）。肠杆菌肽对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.2～1μg/mL（Marvin，2003）， 远低于喹乙醇 12.5 ～ 50 μg/mL（朱庆义，1998），其对革兰氏阴性细菌的抑制杀灭能力好于喹乙醇。本试验在断奶仔猪日粮中添加抗菌肽肠杆菌肽替代原配方中的喹乙醇，研究其对断奶仔猪生产性能的影响，旨在为抗菌肽替代喹乙醇提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 抗菌肽肠杆菌肽 （抗菌肽含量0.5%），林州中农颖泰生物肽有限公司提供。50%喹乙醇（中牧股份），市场购买。

菌株：大肠杆菌ATCC25922，沙门氏菌CVCC50094，金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.2 试验方法

1.2.1 指示菌菌悬液的准备 细菌复苏：指示菌菌种均平板划线，37℃培养20 h；挑取单菌落于MH液体培养基，置37℃振荡培养12～14 h。用生理盐水将菌液稀释至OD600吸光值为0.1（约108cfu/mL）。

1.2.2 抗菌肽肠杆菌肽的处理 先配制产品原液，称取1.28 g样品定容于100 mL提取液（配制方法：量取400 mL超纯水，加入58.44氯化钠摇晃至溶解，然后向其中加入500 mL无水乙醇充分混匀，再向溶液中加超纯水定容至1000 mL，并用NaOH调节pH=7.5～8.0），制成12800μg/mL的样品液，振荡混合均匀。吸取适量上述溶液于具塞灭菌离心管中，5000 r/min离心2 min，取上清液于0.22μm滤膜过滤，取过滤液，将前面过滤的1 mL左右液体弃去，收集后面过滤的液体，备用。

喹乙醇处理方法同上，其样品溶于无菌水，其他操作相同。

1.2.3 抑菌试验 根据美国临床实验室标准化协会 （CLSI，2009）推荐的微量稀释法参考方案（M27-A8）测定抗菌药物对指示菌株的MIC值，接种菌量为5×105cfu／mL，具体方法：用微量加液器取50μL培养基加入96孔板1～11孔，第12孔100μL然后在第一孔中加入50μL实验药物，依次进行两倍稀释，肠杆菌肽浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，其产品依次为 6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5 μg/mL，然后加入50μL细菌悬液，则浓度依次为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 、0.0625 μg/mL， 其产 品 依 次 为 6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL， 微量板 37 ℃培养16 h观察结果。

1.2.4 试验动物及设计 试验挑选8栏健康的平均断奶28日龄左右、断奶方式一致、平均断奶体重7.0 kg左右的仔猪，分为2个处理组，分别为喹乙醇组、抗菌肽组，每个处理组4个重复，每个重复18～19头。保证各处理间初始体重无明显差异。试验前3天保健，不使用抗生素等药物，试验期为10 d。试验用基础日粮配方及营养水平见表1。各个处理组日粮中药物添加见表2。

试验猪在断奶前按猪场的正常饲养管理规定进行饲养和免疫。试验期间自由采食，同时提供充足洁净的饮水。圈舍内温度控制在23～25℃，每天做圈舍清扫，每周进行猪场消毒，疾病的防治与保健猪场实际情况进行。

表1 基础日粮配方及营养水平

表2 各处理组日粮药物添加方案

1.2.5 检测指标与方法 记录每栏初重、末重、饲料消耗量，每天记录每栏采食量折算每头日采食量，每日上午和下午喂料时各观察统计一次并做好记录每栏腹泻猪头数。

日增重/（g/d）=（试验末总重+试验期死亡/淘汰的动物总重-试验初总重）/试验头日数，其中试验头日数应包括淘汰的猪试验天数内。

料重比=总耗料/总增重；

腹泻率/%=（腹泻头数×腹泻天数）/（试验猪头数×试验天数）×100；

大肠杆菌计数：采用梯度稀释法，将粪便溶于无菌水中，涂布于麦康凯琼脂（北京陆桥技术股份有限公司），计数显金属光泽的紫色菌落数；

乳酸菌：采用梯度稀释法，将粪便溶于无菌水中，涂布于MRS琼脂（北京陆桥技术股份有限公司），厌氧培养，菌落计数；

总好氧菌：采用梯度稀释法，将粪便溶于无菌水中，涂布于营养琼脂（北京陆桥技术股份有限公司），菌落计数；

总厌氧菌：采用梯度稀释法，将粪便溶于无菌水中，涂布于EG琼脂培养基（上海康朗生物科技有限公司），菌落计数；

仔猪皮毛指数：试验结束时对仔猪的外观进行逐头评分，具体方法见表3。

皮毛指数=皮肤红润程度+毛色亮度+毛顺程度。

表3 仔猪外观评分标准

1.3 数据统计分析 试验数据采用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽肠杆菌肽与喹乙醇对不同菌株最低抑菌浓度的比较 由表4可知，以大肠杆菌ATCC25922为指示菌株，0.5%肠杆菌肽与50%喹乙醇最低抑菌浓度均为400μg/mL，而相对于沙门氏菌CVCC50094，0.5%肠杆菌肽的最低抑菌浓度为200μg/mL，低于50%喹乙醇最低抑菌浓400μg/mL。肠杆菌肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌无抑菌作用。

2.2 抗菌肽肠杆菌肽替代硫酸黏杆菌素和喹乙醇对断奶仔猪生产性能的影响 抗菌肽肠杆菌肽替代喹乙醇对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响见表5。同喹乙醇组相比，抗菌肽组日增重提高了3.1%、采食量提高了2.9%（P＞0.05）、料肉比相同，腹泻率降低，整个试验期无仔猪死亡。

表4 肠杆菌肽与喹乙醇对不同菌株最低抑菌浓度的比较μg/mL

表5 抗菌肽替代硫酸黏杆菌素和喹乙醇对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响

2.3 抗菌肽替代硫酸黏杆菌素和喹乙醇对断奶仔猪粪便菌群和皮毛指数的影响 表6结果表明，与对照组相比，肠杆菌肽的添加能明显降低肠道中大肠杆菌的数量（P＜0.05），但对于乳酸菌数和总好氧菌数没有影响。使用肠杆菌肽组的皮毛好于喹乙醇组，差异显著（P＜0.05）。

表6 抗菌肽替代硫酸黏杆菌素和喹乙醇对断奶仔猪粪便菌群和皮毛指数的影响

3 讨论

传统抗生素的发现和应用为治疗感染性疾病提供了非常有效的途径，也显著提高了动物食品产品的数量。尽管目前抗生素治疗仍然是应对人类及动物微生物感染的首选方法，但是，细菌对传统抗生素耐药性的产生已经引起越来越多公众对健康问题的关注，驱使科学家们开始寻找安全的新型抗菌剂。抗菌肽分子量小、水溶性好、热稳定性较高、生物功能多样，有着与传统抗生素不同的杀菌机制，不易导致耐药性菌株的产生。目前发现的抗菌肽已达到两千多种，不同种类抗菌肽的抗菌谱、抗菌活性、作用机制存在很大的差异（McPhee，2005；Blazyk，2001）。

肠杆菌肽是一种新型抗菌肽，许多研究表明，肠杆菌肽对革兰氏阴性菌如大肠杆菌和沙门氏菌有极其良好的杀灭作用。Sophie等（2000）研究发现，肠杆菌肽纯品对E.coli O157:H7最低抑菌浓度为1μg/mL。Fabian等（2007）研究显示，其对沙门氏菌最低抑菌浓度为3.12μg/mL，这些研究都表明，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌具有很强的抑菌效果。目前，一些学者认为肠杆菌肽是通过破坏细菌细胞膜和抑制RNA转录这两种机理来抑制大肠杆菌和沙门氏菌（Maria，2001）。本试验以大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌CVCC50094以及金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌，测定肠杆菌肽和50%喹乙醇的最低抑菌浓度发现，以大肠杆菌ATCC25922为指示菌株，0.5%肠杆菌肽与50%喹乙醇最低抑菌浓度均为400μg/mL，而相对于沙门氏菌CVCC50094，0.5%肠杆菌肽的最低抑菌浓度为200μg/mL，低于50%喹乙醇最低抑菌浓400μg/mL。肠杆菌肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌无抑菌作用。结果表明，针对大肠杆菌ATCC25922，0.5%肠杆菌肽与50%喹乙醇抑菌能力相当，而针对沙门氏菌，0.5%肠杆菌肽的抑菌能力要优于50%喹乙醇。

研究结果显示，抗菌肽可替代抗生素类饲料添加剂在猪、鸡、鸭等动物上使用（陈晓生，2005；马为明，2004；温刘发，2001）。 孙何军等（2006）研究发现，蛋鸡日粮中加入肠杆菌肽可以提高蛋鸡生产性能，提高效益。在本试验条件下，在断奶阶段，日粮中添加肠杆菌肽可以替代喹乙醇，替代后生产性能及腹泻率不受影响，肠道中的大肠杆菌数量相对于喹乙醇组显著降低，乳酸菌数有所提高，大肠杆菌是埃希氏大肠杆菌的某些血清致病型所引起的多种疾病的总称，可引起畜禽败血症、肠炎性、泄殖腔炎等疾病，而乳酸菌作为人和动物肠道的正常菌群，具有许多的益生特性，其能维持动物肠道菌群平衡，促进动物对营养物质的吸收，提高动物机体的免疫力等。本试验结果显示，针对肠道菌群，肠杆菌肽组优于喹乙醇组，抗菌肽肠杆菌肽可以作为潜在的抗生素替代品在动物生产中应用。