超高效液相色谱法测定曲匹布通含量

罗雨阳，朱跃芳 ，石文松，陈阳桔

（湖南省株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 412000）

曲匹布通为利胆药，可松弛胆道括约肌，降低胆管内压，促进胆汁和胰液的排放，使胆总管胆汁充盈，且有解痉镇痛及利胆消炎的作用[1－2]。曲匹布通质量标准收载于化学药品地方标准上升国家标准第四册[3]，《中国药典》暂无收载。现行曲匹布通国家标准中含量测定采用容量法[4]，该方法较烦琐，取样量大，且制剂辅料严重干扰终点的判断，专属性较差。目前，曲匹布通含量的检测方法主要有容量法、紫外法[5]和高效液相色谱法[6－13]。本研究中建立了超高效液相色谱（UPLC）DAD检测器测定曲匹布通含量的分析方法[14－15]，经方法学论证，结合大量样品（包括国外原研制剂和国内仿制药）分析数据，证实方法简单、快速、准确，能为曲匹布通的质量控制提供一定的参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290型超高液相色谱议，配备 DAD检测器，Chemistation数据处理系统（美国安捷伦公司）；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

曲匹布通原料药（湖南千金湘江药业股份有限公司，批号分别为 20160504，20160505，20170101）；曲匹布通片（湖南千金湘江药业股份有限公司，批号分别为150501，160501，161101，171001，规格为每片 40 mg）；曲匹布通片（日本大原药品工业株式会社，批号分别为HH88，KF93，规格为每片 40 mg）；曲匹布通对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100439－200301）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；冰醋酸、醋酸钠试剂（分析纯，国药集团）；水为实验室自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis®T3柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）；流动相：0.01 mol／L 醋酸钠溶液（用冰醋酸调节pH 至 3.0）－ 甲醇（40∶60）；流速:0.5 mL ／min；进样量：1 μL；柱温:35℃；DAD 检测器扫描波长：190～400 nm；检测波长:271 nm。

2.2 溶液制备

取曲匹布通片辅料41.9 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为阴性对照品溶液。取曲匹布通对照品12.5 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。另取曲匹布通样品（批号为170101）25.1 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液分别进样，结果曲匹布通供试品溶液与对照品溶液色谱峰保留时间均为2.07 min，两者DAD扫描光谱图一致，且阴性对照品溶液在相应保留时间处无明显色谱峰，表明辅料不干扰样品测定。色谱图见图1。

图1 超高效液相色谱图

线性关系考察：取曲匹布通对照品25.01 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取 0.4，0.8，1.2，2.0，4.0 mL 置 5 个 10 mL容量瓶中，用流动相稀释成质量浓度分别为0.100 04，0.200 08，0.300 12，0.500 20，1.000 40 g ／L 的系列溶液，按拟订色谱条件测定，记录色谱图。以曲匹布通的峰面积（Y）对质量浓度（X，g／L）绘制标准曲线，得线性方程 Y＝3 267.003 77X＋25.157 508，r＝0.999 92（n＝5）。表明曲匹布通质量浓度在0.100 04～1.000 40 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

重复性试验：取曲匹布通原粉（批号为20160504）及曲匹布通片（批号为150501），各6份，进行重复性试验，以精密度试验结果计算对照品含量，曲匹布通原粉含量均值为100.70%，RSD为0.5%（n＝6），曲匹布通片含量均值为100.75%，RSD为0.5%（n＝6），表明方法重复性良好。

精密度试验：取同一曲匹布通对照品溶液，在271 nm波长处连续进样5次。结果的 RSD为0.3%（n＝5），表明仪器精密度较好。

加样回收试验：取曲匹布通原料（批号为170101）9份，按湖南千金湘江药业股份有限公司处方添加相应的空白辅料，配制成曲匹布通低、中、高3个质量浓度的溶液，另取同批号曲匹布通原料2份，配制成相应浓度的对照品溶液，按外标法计算回收率。结果见表1。

表1 曲匹布通加样回收试验结果（n＝9）

耐用性试验：取同一批（批号为171001）供试品溶液，分别用色谱柱Waters Atlantis®T3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），Zorbax RRHD Extend－C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.8 μm），Agela Venusil MP C18柱 （33 mm × 4.6 mm，3 μm），按拟订色谱条件进行测定。结果显示，使用不同色谱柱曲匹布通含量测定结果基本一致，结果的 RSD为1.1%（n＝6），表明试验耐用性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20160505）供试品溶液，按拟订色谱条件分别在配制后 0，2，4，6，8，10，12，18 h时进样。结果显示，曲匹布通峰面积的 RSD为0.7%（n＝8），表明供试品溶液在18 h内稳定。

2.4 样品含量测定

取曲匹布通供试品约25 mg，精密称定，置50 mL溶量瓶中，加流动相溶解（必要时超声）并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取1 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取曲匹布通对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。同时对3批曲匹布通原粉、6批曲匹布通片进行检测，其含量测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果（%，n＝9）

3 讨论

3.1 色谱条件优化

曲匹布通易溶于甲醇，难溶于水，故采用甲醇－水的流动相体系，但此体系下曲匹布通主峰有拖尾现象。参考文献[11]，引入缓冲盐能改善峰形，醋酸盐缓冲体系能较好地解决曲匹布通峰拖尾问题，故采用醋酸钠溶液作为缓冲溶液。考察不同流动相pH对峰型的影响，结果pH为3.0时，出峰时间适宜，峰形较好。同时，考察了不同流速对出峰时间的影响，结果流速为0.5 mL／min时，曲匹布通出峰时间为2.07 min，且无杂质峰干扰，故选择流速0.5 mL／min。考察不同进样量的影响，结果进样量为1～5 μL时，曲匹布通峰形均较好，为保护色谱柱，延长色谱柱的使用周期，采用1 μL作为进样量。

3.2 最佳检测波长选择

根据试验要求，将曲匹布通与流动相结合，用DAD检测器进行全波长扫描，考察最佳检测波长，波长为235 nm时曲匹布通峰面积响应值最大，但考虑存在末端吸收的情况，最终确定曲匹布通检测波长为271 nm。

3.3 对照品选择

目前，曲匹布通对照品为供紫外检测法检查溶出度用的对照品，用国家标准中的滴定法进行测定，其含量低于湖南千金湘江药业股份有限公司提供的原料，故选择企业提供的原料（批号为170201）作为含量测定的对照品。